Estructura cristalina de I-CreI unida a su secuencia de reconocimiento de ADN . La enzima se une como un homodímero; una subunidad se representa en amarillo y la otra en rosa. La enzima se muestra en representación de superficie; la molécula de ADN se muestra como una colección de esferas, cada una coloreada de acuerdo con su elemento químico .
Las endonucleasas homing son una colección de endonucleasas codificadas como genes independientes dentro de intrones , como fusiones con proteínas del huésped o como inteínas autoempalmables . Catalizan la hidrólisis del ADN genómico dentro de las células que las sintetizan, pero lo hacen en muy pocos lugares, o incluso en lugares singulares. La reparación del ADN hidrolizado por la célula huésped con frecuencia da como resultado que el gen que codifica la endonucleasa homing se haya copiado en el sitio de escisión, de ahí el término "homing" para describir el movimiento de estos genes. Las endonucleasas homing pueden así transmitir sus genes horizontalmente dentro de una población huésped, aumentando su frecuencia de alelos a tasas mayores que las mendelianas.
Origen y mecanismo
Aunque el origen y función de las endonucleasas homing aún se encuentra en investigación, la hipótesis más establecida las considera como elementos genéticos egoístas , [1] similares a los transposones , porque facilitan la perpetuación de los elementos genéticos que las codifican independientemente de proporcionar un atributo funcional al organismo huésped.
Las secuencias de reconocimiento de endonucleasas homing son lo suficientemente largas como para ocurrir aleatoriamente solo con una probabilidad muy baja (aproximadamente una vez cada 100 años).7 × 10 9 pb ), [2] y normalmente se encuentran en una o muy pocas instancias por genoma . Generalmente, debido al mecanismo de homing, el gen que codifica la endonucleasa (el HEG, "gen de endonucleasa homing") se encuentra dentro de la secuencia de reconocimiento que corta la enzima, interrumpiendo así la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa homing y limitando el corte de ADN solo a sitios que no portan (aún) el HEG.
Antes de la transmisión, un alelo porta el gen (HEG + ) mientras que el otro no (HEG − ), y por lo tanto es susceptible de ser cortado por la enzima. Una vez que la enzima se sintetiza, rompe el cromosoma en el alelo HEG − , iniciando una respuesta del sistema de reparación del ADN celular. El daño se repara mediante recombinación , tomando el patrón del alelo de ADN opuesto, no dañado, HEG + , que contiene el gen para la endonucleasa. De esta manera, el gen se copia al alelo que inicialmente no lo tenía y se propaga a través de generaciones sucesivas. [3] Este proceso se llama "homing". [3]
Nomenclatura
Las endonucleasas homing siempre se indican con un prefijo que identifica su origen genómico, seguido de un guion: "I-" para las endonucleasas homing codificadas dentro de un intrón, "PI-" (de "inserto proteico") para las codificadas dentro de una inteína. Algunos autores han propuesto utilizar el prefijo "F-" ("freestanding") para las enzimas virales y otras enzimas naturales no codificadas por intrones ni inteínas, [4] y "H-" ("hybrid") para las enzimas sintetizadas en un laboratorio. [5] A continuación, se deriva un nombre de tres letras del nombre binominal del organismo, tomando una letra mayúscula del nombre del género y dos letras minúsculas del nombre específico . (Se suele realizar alguna mezcla para las enzimas híbridas). Finalmente, un número romano distingue diferentes enzimas que se encuentran en el mismo organismo:
PI-TliII ( P30317 ) es la segunda enzima identificada codificada por una inteína que se encuentra en la arquea Thermococcus litoralis . [6] [7] [8]
H-DreI ( PDB : 1MOW ) es la primera endonucleasa homing sintética, creada en un laboratorio a partir de las enzimas I-DmoI ( P21505 ) e I-CreI ( P05725 ), tomadas respectivamente de Desulfurococcus mobilis y Chlamydomonas reinhardtii . [5] [9]
Las endonucleasas homing son generalmente más tolerantes a las sustituciones en la secuencia de reconocimiento. Las variaciones menores en la secuencia de reconocimiento suelen reducir la actividad de las endonucleasas homing, pero a menudo no la eliminan por completo, como suele ocurrir con las enzimas de restricción. [10] [11]
Las endonucleasas homing comparten motivos estructurales que sugieren que hay cuatro familias, mientras que no ha sido posible determinar familias simplemente reconocibles y distinguibles de enzimas de restricción Tipo II.
Las endonucleasas homing actúan como monómeros u homodímeros , y a menudo requieren proteínas asociadas para regular su actividad [12] o formar complejos de ribonucleoproteína , donde el ARN es un componente integral del aparato catalítico. [13] Las enzimas de restricción de tipo II también pueden funcionar solas, como monómeros u homodímeros, [14] o con subunidades proteicas adicionales , [15] pero las subunidades accesorias difieren de las de las endonucleasas homing. Por lo tanto, pueden requerir subunidades de restricción, modificación y especificidad para su acción. [15]
Finalmente, las endonucleasas homing tienen una distribución filogenética más amplia, ocurriendo en los tres dominios biológicos : arqueas , bacterias y eucariotas . Las enzimas de restricción de tipo II solo ocurren en arqueas, bacterias y ciertos virus. [16] [17] [18] Las endonucleasas homing también se expresan en los tres compartimentos de la célula eucariota: núcleos , mitocondrias y cloroplastos . Los marcos de lectura abiertos que codifican endonucleasas homing se han encontrado en intrones , inteínas y en forma independiente entre genes, mientras que los genes que codifican genes de enzimas de restricción de tipo II se han encontrado solo en forma independiente, casi siempre en estrecha asociación con genes que codifican enzimas modificadoras de ADN cognadas. [19] Por lo tanto, mientras que las enzimas de restricción de tipo II y las endonucleasas homing comparten la función de escindir ADN bicatenario, parecen haber evolucionado de forma independiente.
Familias estructurales
Actualmente se conocen seis familias estructurales cuyos motivos estructurales conservados son: [4]
LAGLIDADG: Cada polipéptido tiene 1 o 2 motivos LAGLIDADG. La secuencia LAGLIDADG es una secuencia conservada de aminoácidos donde cada letra es un código que identifica un residuo específico. Esta secuencia está directamente involucrada en el proceso de corte del ADN. Aquellas enzimas que tienen un solo motivo funcionan como homodímeros, creando una silla de montar que interactúa con el surco mayor de cada semisitio del ADN. Los motivos LAGLIDADG aportan residuos de aminoácidos tanto a la interfaz proteína-proteína entre dominios o subunidades proteicas, como a los sitios activos de la enzima. Las enzimas que poseen dos motivos en una sola cadena proteica actúan como monómeros, creando la silla de montar de manera similar. Las primeras estructuras de endonucleasas homing que se determinaron (de PI-SceI e I-CreI, ambas descritas en 1997) eran de la familia estructural LAGLIDADG., [20] [21] Al año siguiente, también se informó la primera estructura de una endonucleasa homing (I-CreI) unida a su sitio objetivo de ADN. [9]
GIY-YIG: Tienen un solo motivo GIY-YIG, en la región N-terminal , que interactúa con el ADN en el sitio de corte. La enzima prototípica de esta familia es I-TevI, que actúa como monómero. Se han publicado estudios estructurales separados de los dominios catalíticos y de unión al ADN de I-TevI, el primero unido a su ADN diana y el segundo en ausencia de ADN. [22] [23]
Caja His-Cys ( Pfam PF05551): Estas enzimas poseen una región de 30 aminoácidos que incluye 5 residuos conservados: dos histidinas y tres cisteínas . Coordinan el catión metálico necesario para la catálisis. I-PpoI es la enzima mejor caracterizada de esta familia y actúa como un homodímero. Su estructura fue reportada en 1998. [24] Posiblemente esté relacionada con la familia HNH, ya que comparten características comunes. [25]
HNH: ( Pfam CL0263 ): Tienen una secuencia de consenso de aproximadamente 30 aminoácidos. Incluye dos pares de histidinas conservadas y una asparagina que crean un dominio de dedo de zinc . I-HmuI ( P34081 ) es la enzima mejor caracterizada de esta familia y actúa como un monómero. Su estructura fue reportada en 2004 ( PDB : 1U3E ). [26]
PD-(D/E)xK ( Pfam CL0236): Estas enzimas contienen un dominio catalítico de nucleasa canónica que se encuentra típicamente en las endonucleasas de restricción de tipo II. La enzima mejor caracterizada de esta familia, I-Ssp6803I ( Q57253 ), actúa como un tetrámero. Su estructura fue reportada en 2007 ( PDB : 2OST ). [27] El plegamiento general se conserva en muchas familias de endonucleasas, todas las cuales pertenecen a la superfamilia PD-(D/E)xK. [28]
Vsr-like/EDxHD (DUF559, InterPro : IPR007569 ): estas enzimas fueron descubiertas en la base de datos metagenómica de muestreo global de océanos y descritas por primera vez en 2009. El término "Vsr-like" se refiere a la presencia de un dominio de nucleasa C-terminal que muestra una homología reconocible con las endonucleasas de reparación de parches muy cortos (Vsr) bacterianas. [29] La estructura se resolvió en 2011, lo que confirma la homología de Vsr. [30] Se considera parte de la superfamilia PD-(D/E)xk. [28]
Arquitectura de dominio
La endonucleasa homing de levadura PI-Sce es una endonucleasa de tipo LAGLIDADG codificada como una inteína que se empalma a sí misma a partir de otra proteína ( P17255 ). La estructura de alta resolución revela dos dominios : un centro endonucleolítico que se asemeja al dominio C-terminal de las proteínas Hedgehog y un dominio Hint (Hedgehog/Inteína) que contiene el sitio activo de empalme de proteínas . [31]
Véase también
REBASE , una base de datos integral de enzimas de restricción de New England Biolabs con enlaces a literatura relacionada.
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Enlaces externos
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