I- Cre I es una endonucleasa homing cuyo gen fue descubierto por primera vez en el genoma del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii , una especie de alga verde unicelular . [ 1 ] Recibe su nombre por los hechos de que: reside en un ntrón I ; fue aislado de C. reinhardtii ; fue el primer ( I ) gen de este tipo aislado de C. reinhardtii . Su gen reside en un intrón del grupo I en el gen del ARN ribosómico 23S del cloroplasto de C. reinhardtii , y I- Cre I solo se expresa cuando su ARNm se empalma a partir de la transcripción primaria del gen 23S. La enzima I- Cre I , que funciona como un homodímero , reconoce una secuencia de 22 nucleótidos de ADN dúplex y escinde un enlace fosfodiéster en cada hebra en posiciones específicas. I- Cre I es un miembro de la familia LAGLIDADG de endonucleasas homing, todas las cuales tienen un motivo de aminoácidos LAGLIDADG conservado que contribuye a sus dominios asociativos y sitios activos. Cuando el intrón que contiene I- Cre I encuentra un alelo 23S que carece del intrón, la enzima I- Cre I "se aloja" en el alelo "intrón-menos" de 23S y efectúa la inserción de su intrón progenitor en el alelo intrón-menos. Los intrones con este comportamiento se denominan intrones móviles. Debido a que I- Cre I permite su propia propagación sin conferir ningún beneficio a su anfitrión, es un ejemplo de ADN egoísta .
I- Cre I se observó por primera vez como una secuencia intermedia en el gen ARNr 23S del genoma del cloroplasto de C. reinhardtii . [1] El gen 23S es un gen de ARN , lo que significa que su transcripción no se traduce en proteína. Como ARN, forma parte de la subunidad grande del ribosoma . Se encontró un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 163 aminoácidos en este intrón 23S, lo que sugiere que una proteína podría facilitar el comportamiento de retorno al hogar del intrón móvil. Además, la proteína predicha tenía un motivo LAGLIDADG, una secuencia de aminoácidos conservada que está presente en otras proteínas codificadas en intrones móviles del grupo I. Un estudio de 1991 estableció que el ORF codifica una endonucleasa de ADN, I- Cre I, que corta selectivamente un sitio correspondiente a donde el intrón se empalma fuera de la transcripción primaria 23S. [2] El estudio también mostró que el intrón era capaz de invadir alelos 23S que aún no lo tenían. [2]
El I- Cre I ha evolucionado para cortar una secuencia de 22 nucleótidos de ADN que se encuentra en alelos del gen del ARN ribosómico 23S que carecen del intrón que contiene el I- Cre I. Cuando se corta un alelo "intrón-menos", se activan en la célula vías de reparación de roturas de doble cadena . La célula utiliza como plantilla para la reparación el alelo 23S que produjo la enzima responsable I- Cre I, replicando así el intrón que contiene el I- Cre I. [3] El alelo "intrón-más" resultante ya no contiene un sitio de alojamiento intacto para la enzima I- Cre I y, por lo tanto, no se corta. Dado que este intrón permite su propia replicación sin conferir ningún beneficio a su anfitrión, el I- Cre I es una forma de ADN egoísta .
Debido a que I- Cre I ha evolucionado para cortar una secuencia tan larga de ADN, a diferencia de las endonucleasas de restricción que típicamente cortan secuencias de cuatro o seis nucleótidos, es capaz de cortar un solo sitio dentro de un genoma muy grande . Se espera que una secuencia de cuatro o seis nucleótidos ocurra muchas, muchas veces en un genoma de millones o miles de millones de nucleótidos simplemente por casualidad, mientras que una secuencia de 22 nucleótidos podría ocurrir solo una vez (10 9 /4 6 frente a 10 9 /4 22 ). Esta especificidad de la escisión de I- Cre I hace que I- Cre I sea una herramienta prometedora para la orientación genética . Si una persona tuviera una enfermedad debido a un alelo defectuoso de algún gen , sería útil poder reemplazar ese alelo con uno funcional. Si uno pudiera hacer que I- Cre I cortara el ADN solo en el alelo defectuoso mientras que simultáneamente proporciona un alelo normal para que la célula lo use como plantilla de reparación, la propia maquinaria de recombinación homóloga del paciente podría insertar el alelo deseado en lugar del disfuncional. La especificidad de I- Cre I también permite la reducción de efectos nocivos debidos a roturas de doble cadena fuera del gen de interés.
Para utilizar I- CreI como herramienta de esta manera, es necesario hacer que reconozca y corte secuencias de ADN diferentes de su sitio de origen. En 1997 se creó un sistema genético de Escherichia coli para estudiar la relación entre la estructura de I- CreI y su especificidad del sitio de origen. [5] En 1997, se determinó la estructura de la proteína I-CreI, [6] y en 1998, se resolvió su estructura cristalina unida a su sitio de origen de ADN nativo, lo que ayudó en gran medida a la investigación para alterar el reconocimiento del sitio de origen de la proteína. [4] Desde entonces, se han creado formas mutantes de la proteína que exhiben una especificidad del sitio de origen alterada. [7] [8] [9] También se ha creado un sistema genético en Saccharomyces cerevisiae , que produce mutantes adicionales de I- CreI con especificidades del sitio de origen modificadas. [10] [11]
Ya se ha utilizado con éxito I- Cre I para inducir la recombinación homóloga en Drosophila melanogaster , un organismo modelo eucariota extremadamente popular . [12] Parece muy probable que los avances en las técnicas de biología molecular y la generación de una biblioteca de nuevas endonucleasas derivadas de I- Cre I eventualmente permitan la focalización de muchos genes de importancia etiológica.