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Transformación (genética)

En esta imagen, un gen de una célula bacteriana se traslada a otra célula bacteriana. Este proceso en el que la segunda célula bacteriana absorbe nuevo material genético se llama transformación.

En biología molecular y genética , transformación es la alteración genética de una célula resultante de la captación e incorporación directa de material genético exógeno de su entorno a través de la (s ) membrana(s) celular (es). Para que se produzca la transformación, la bacteria receptora debe estar en un estado de competencia , lo que podría ocurrir en la naturaleza como una respuesta de tiempo limitado a condiciones ambientales como el hambre y la densidad celular, y también puede inducirse en un laboratorio. [1]

La transformación es uno de los tres procesos que conducen a la transferencia horizontal de genes , en los que el material genético exógeno pasa de una bacteria a otra, siendo los otros dos la conjugación (transferencia de material genético entre dos células bacterianas en contacto directo) y la transducción (inyección de ADN extraño ). por un virus bacteriófago en la bacteria huésped). [1] En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio y la absorción depende completamente de la bacteria receptora. [1]

En 2014, se sabía que alrededor de 80 especies de bacterias eran capaces de transformación, divididas aproximadamente en partes iguales entre bacterias Gram positivas y Gram negativas ; la cifra podría ser una sobreestimación, ya que varios de los informes están respaldados por artículos únicos. [1]

"Transformación" también puede usarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas células animales y vegetales; sin embargo, debido a que " transformación " tiene un significado especial en relación con las células animales, indicando progresión a un estado canceroso, el proceso generalmente se llama " transfección ". [2]

Historia

La transformación en bacterias fue demostrada por primera vez en 1928 por el bacteriólogo británico Frederick Griffith . [3] Griffith estaba interesado en determinar si las inyecciones de bacterias muertas por calor podrían usarse para vacunar ratones contra la neumonía. Sin embargo, descubrió que una cepa no virulenta de Streptococcus pneumoniae podía volverse virulenta después de exponerse a cepas virulentas muertas por calor. Griffith planteó la hipótesis de que algún " principio transformador " de la cepa muerta por calor era responsable de hacer virulenta a la cepa inofensiva. En 1944, Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty identificaron este "principio transformador" como genético . Aislaron ADN de una cepa virulenta de S. pneumoniae y usando solo este ADN pudieron hacer virulenta una cepa inofensiva. Llamaron a esta captación e incorporación de ADN por parte de las bacterias "transformación" (Ver experimento de Avery-MacLeod-McCarty ) [4] Los resultados de los experimentos de Avery et al. fueron recibidos con escepticismo al principio por la comunidad científica y no fue hasta el El desarrollo de marcadores genéticos y el descubrimiento de otros métodos de transferencia genética ( conjugación en 1947 y transducción en 1953) por Joshua Lederberg hicieron que los experimentos de Avery fueran aceptados. [5]

Originalmente se pensó que Escherichia coli , un organismo de laboratorio comúnmente utilizado, era refractario a la transformación. Sin embargo, en 1970, Morton Mandel y Akiko Higa demostraron que se puede inducir a E. coli a absorber ADN del bacteriófago λ sin el uso de fagos auxiliares después del tratamiento con una solución de cloruro de calcio. [6] Dos años más tarde, en 1972, Stanley Norman Cohen , Annie Chang y Leslie Hsu demostraron que CaCl
2El tratamiento también es eficaz para la transformación del ADN plasmídico. [7] El método de transformación de Mandel e Higa fue posteriormente mejorado por Douglas Hanahan . [8] El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en E. coli creó un procedimiento eficiente y conveniente para transformar bacterias que permite métodos de clonación molecular más simples en biotecnología e investigación , y ahora es un procedimiento de laboratorio de uso rutinario.

La transformación mediante electroporación se desarrolló a finales de la década de 1980, aumentando la eficiencia de la transformación in vitro y aumentando el número de cepas bacterianas que podían transformarse. [9] La transformación de células animales y vegetales también se investigó y el primer ratón transgénico se creó inyectando un gen para una hormona de crecimiento de rata en un embrión de ratón en 1982. [10] En 1897, una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens , Se descubrió y, a principios de la década de 1970, se descubrió que el agente inductor de tumores era un plásmido de ADN llamado plásmido Ti . [11] Al eliminar los genes del plásmido que causó el tumor y agregar genes nuevos, los investigadores pudieron infectar plantas con A. tumefaciens y permitir que las bacterias insertaran el ADN elegido en los genomas de las plantas. [12] No todas las células vegetales son susceptibles a la infección por A. tumefaciens , por lo que se desarrollaron otros métodos, incluida la electroporación y la microinyección . [13] El bombardeo de partículas fue posible gracias a la invención del sistema biolístico de entrega de partículas (pistola genética) por John Sanford en la década de 1980. [14] [15] [16]

Definiciones

La transformación es una de las tres formas de transferencia horizontal de genes que ocurren en la naturaleza entre bacterias, en las que el ADN que codifica un rasgo pasa de una bacteria a otra y se integra en el genoma receptor mediante recombinación homóloga ; los otros dos son la transducción , realizada por medio de un bacteriófago , y la conjugación , en la que se pasa un gen mediante el contacto directo entre bacterias. [1] En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio y la absorción depende completamente de la bacteria receptora. [1]

La competencia se refiere a un estado temporal de capacidad para absorber ADN exógeno del medio ambiente; puede ser inducido en un laboratorio. [1]

Parece ser un proceso antiguo heredado de un ancestro procariótico común que es una adaptación beneficiosa para promover la reparación recombinacional del daño del ADN, especialmente el daño adquirido en condiciones estresantes. La transformación genética natural parece ser una adaptación para reparar el daño del ADN que también genera diversidad genética . [1] [17]

La transformación se ha estudiado en especies de bacterias Gram-negativas de importancia médica como Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae y Vibrio cholerae . [18] También se ha estudiado en especies gramnegativas que se encuentran en el suelo como Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi y patógenos vegetales gramnegativos como Ralstonia solanacearum y Xylella fastidiosa . [18] La transformación entre bacterias Gram positivas se ha estudiado en especies de importancia médica como Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus y Streptococcus sanguinis y en bacterias Gram positivas del suelo Bacillus subtilis . [17] También se ha informado en al menos 30 especies de Pseudomonadota distribuidas en varias clases diferentes. [19] Los Pseudomonadota mejor estudiados con respecto a la transformación son los patógenos humanos de importancia médica Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae y Helicobacter pylori . [17]

"Transformación" también puede usarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas células animales y vegetales; sin embargo, debido a que " transformación " tiene un significado especial en relación con las células animales, indicando progresión a un estado canceroso, el proceso generalmente se llama " transfección ". [2]

Competencia natural y transformación.

Las bacterias naturalmente competentes portan conjuntos de genes que proporcionan la maquinaria proteica para hacer pasar el ADN a través de las membranas celulares. El transporte del ADN exógeno al interior de las células puede requerir proteínas que participan en el ensamblaje de los pili tipo IV y el sistema de secreción tipo II , así como el complejo de ADN translocasa en la membrana citoplasmática. [20]

Debido a las diferencias en la estructura de la envoltura celular entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, existen algunas diferencias en los mecanismos de captación de ADN en estas células; sin embargo, la mayoría de ellas comparten características comunes que involucran proteínas relacionadas. El ADN primero se une a la superficie de las células competentes en un receptor de ADN y pasa a través de la membrana citoplasmática a través de la translocasa de ADN. [21] Sólo puede pasar ADN monocatenario, siendo la otra hebra degradada por nucleasas en el proceso. El ADN monocatenario translocado puede luego integrarse en los cromosomas bacterianos mediante un proceso dependiente de RecA . En las células Gram negativas, debido a la presencia de una membrana extra, el ADN requiere la presencia de un canal formado por secretinas en la membrana externa. Es posible que Pilin sea necesario para su competencia, pero su papel es incierto. [22] La captación de ADN generalmente no es específica de una secuencia, aunque en algunas especies la presencia de secuencias de captación de ADN específicas puede facilitar una captación eficiente de ADN. [23]

Transformación natural

La transformación natural es una adaptación bacteriana para la transferencia de ADN que depende de la expresión de numerosos genes bacterianos cuyos productos parecen ser responsables de este proceso. [20] [19] En general, la transformación es un proceso de desarrollo complejo que requiere energía. Para que una bacteria se una, absorba y recombine el ADN exógeno en su cromosoma, debe volverse competente, es decir, entrar en un estado fisiológico especial. El desarrollo de competencias en Bacillus subtilis requiere la expresión de unos 40 genes. [24] El ADN integrado en el cromosoma del huésped generalmente se deriva (pero con raras excepciones) de otra bacteria de la misma especie y, por lo tanto, es homólogo al cromosoma residente.

En B. subtilis la longitud del ADN transferido es superior a 1271 kb (más de 1 millón de bases). [25] La longitud transferida probablemente sea ADN de doble hebra y, a menudo, es más de un tercio de la longitud total del cromosoma de 4215 kb. [26] Parece que alrededor del 7-9% de las células receptoras ocupan un cromosoma completo. [27]

La capacidad de transformación natural parece ocurrir en varios procariotas y hasta el momento se sabe que 67 especies procarióticas (en siete filos diferentes) experimentan este proceso. [19]

La competencia para la transformación suele ser inducida por una alta densidad celular y/o limitación nutricional, condiciones asociadas con la fase estacionaria del crecimiento bacteriano. La transformación en Haemophilus influenzae ocurre de manera más eficiente al final del crecimiento exponencial cuando el crecimiento bacteriano se acerca a la fase estacionaria. [28] La transformación en Streptococcus mutans , así como en muchos otros estreptococos, ocurre con una alta densidad celular y está asociada con la formación de biopelículas . [29] La competencia en B. subtilis se induce hacia el final del crecimiento logarítmico, especialmente en condiciones de limitación de aminoácidos. [30] De manera similar, en Micrococcus luteus (un representante del filo Actinomycetota menos estudiado ), la competencia se desarrolla durante la fase de crecimiento exponencial media-tardía y también se desencadena por la falta de aminoácidos. [31] [32]

Se cree que ciertos bacteriófagos contribuyen a la transformación al liberar ADN intacto del huésped y del plásmido . [33]

La transformación, como adaptación para la reparación del ADN.

La competencia es inducida específicamente por condiciones que dañan el ADN. Por ejemplo, la transformación es inducida en Streptococcus pneumoniae por los agentes que dañan el ADN, mitomicina C (un agente de entrecruzamiento del ADN) y fluoroquinolona (un inhibidor de la topoisomerasa que provoca roturas de doble cadena). [34] En B. subtilis , la transformación aumenta con la luz ultravioleta, un agente que daña el ADN. [35] En Helicobacter pylori , la ciprofloxacina, que interactúa con la ADN girasa e introduce roturas de doble hebra, induce la expresión de genes de competencia, mejorando así la frecuencia de transformación [36] Utilizando Legionella pneumophila , Charpentier et al. [37] probaron 64 moléculas tóxicas para determinar cuáles de ellas inducen competencia. De ellos, sólo seis, todos ellos agentes que dañan el ADN, provocaron una fuerte inducción. Estos agentes que dañan el ADN fueron mitomicina C (que causa enlaces cruzados entre las cadenas del ADN), norfloxacina, ofloxacina y ácido nalidíxico (inhibidores de la ADN girasa que causan roturas de doble cadena [38] ), biciclomicina (causa roturas de una y dos cadenas [ 39] ), e hidroxiurea (induce la oxidación de bases del ADN [40] ). La luz ultravioleta también indujo competencia en L. pneumophila . Charpentier et al. [37] sugirieron que la competencia para la transformación probablemente evolucionó como una respuesta al daño del ADN.

Las bacterias que crecen logarítmicamente se diferencian de las bacterias en fase estacionaria con respecto al número de copias del genoma presentes en la célula, y esto tiene implicaciones en la capacidad de llevar a cabo un importante proceso de reparación del ADN . Durante el crecimiento logarítmico, pueden estar presentes dos o más copias de cualquier región particular del cromosoma en una célula bacteriana, ya que la división celular no coincide con precisión con la replicación cromosómica. El proceso de reparación recombinacional homóloga (HRR) es un proceso clave de reparación del ADN que es especialmente eficaz para reparar daños de doble hebra, como roturas de doble hebra. Este proceso depende de un segundo cromosoma homólogo además del cromosoma dañado. Durante el crecimiento logarítmico, HRR puede reparar un daño en el ADN de un cromosoma utilizando información de secuencia del otro cromosoma homólogo. Sin embargo, una vez que las células se acercan a la fase estacionaria, normalmente tienen solo una copia del cromosoma y la HRR requiere la entrada de una plantilla homóloga desde el exterior de la célula mediante transformación. [41]

Para probar si la función adaptativa de la transformación es la reparación de daños en el ADN, se llevaron a cabo una serie de experimentos utilizando B. subtilis irradiado con luz ultravioleta como agente dañino (revisado por Michod et al. [42] y Bernstein et al. [41] ] ) Los resultados de estos experimentos indicaron que la transformación del ADN actúa para reparar daños potencialmente letales en el ADN introducidos por la luz ultravioleta en el ADN receptor. El proceso particular responsable de la reparación probablemente fue HRR. La transformación en bacterias puede verse como un proceso sexual primitivo, ya que implica la interacción del ADN homólogo de dos individuos para formar ADN recombinante que se transmite a las generaciones siguientes. La transformación bacteriana en procariotas pudo haber sido el proceso ancestral que dio lugar a la reproducción sexual meiótica en eucariotas (ver Evolución de la reproducción sexual ; Meiosis .)

Métodos y mecanismos de transformación en laboratorio.

Esquema de la transformación bacteriana, para la cual primero se debe inducir la competencia artificial.

Bacteriano

La competencia artificial puede inducirse en procedimientos de laboratorio que implican hacer que la célula sea pasivamente permeable al ADN exponiéndola a condiciones que normalmente no ocurren en la naturaleza. [43] Normalmente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes (a menudo cloruro de calcio ) en condiciones de frío, antes de exponerlas a un pulso de calor (choque térmico). El cloruro de calcio altera parcialmente la membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante ingrese a la célula huésped. Las células que pueden absorber el ADN se denominan células competentes.

Se ha descubierto que el crecimiento de bacterias Gram negativas en Mg 20 mM reduce el número de enlaces de proteína a lipopolisacárido al aumentar la proporción de enlaces iónicos a covalentes, lo que aumenta la fluidez de la membrana y facilita la transformación. [44] El papel de los lipopolisacáridos aquí se verifica a partir de la observación de que las cadenas del lado O más cortas se transforman de manera más efectiva, tal vez debido a una mejor accesibilidad al ADN.

La superficie de bacterias como E. coli está cargada negativamente debido a los fosfolípidos y lipopolisacáridos de su superficie celular, y el ADN también está cargado negativamente. Por lo tanto, una función del catión divalente sería proteger las cargas coordinando los grupos fosfato y otras cargas negativas, permitiendo así que una molécula de ADN se adhiera a la superficie celular.

La entrada del ADN en las células de E. coli se realiza a través de canales conocidos como zonas de adhesión o unión de Bayer, y una célula típica porta hasta 400 de esas zonas. Su papel se estableció cuando se descubrió que la cobalamina (que también utiliza estos canales) inhibía competitivamente la absorción de ADN. Otro tipo de canal implicado en la captación de ADN consiste en poli (HB):poli P:Ca. En este caso, se prevé que el poli (HB) se envuelva alrededor del ADN (en sí mismo un polifosfato) y se transporte en un escudo formado por iones de Ca. [44]

Se sugiere que exponer las células a cationes divalentes en condiciones de frío también puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de calor crea un desequilibrio térmico a través de la membrana celular, lo que obliga al ADN a ingresar a las células a través de los poros celulares o de la pared celular dañada.

La electroporación es otro método para promover la competencia. En este método, las células reciben una descarga breve con un campo eléctrico de 10-20 kV /cm, que se cree que crea agujeros en la membrana celular a través de los cuales puede entrar el ADN plasmídico. Después de la descarga eléctrica, los mecanismos de reparación de la membrana celular cierran rápidamente los agujeros.

Levadura

La mayoría de las especies de levaduras , incluida Saccharomyces cerevisiae , pueden transformarse mediante ADN exógeno en el medio ambiente. Se han desarrollado varios métodos para facilitar esta transformación a alta frecuencia en el laboratorio. [45]

Eficiencia : diferentes géneros y especies de levaduras captan ADN extraño con diferentes eficiencias. [53] Además, la mayoría de los protocolos de transformación se han desarrollado para la levadura de panadería, S. cerevisiae , y por lo tanto pueden no ser óptimos para otras especies. Incluso dentro de una misma especie, diferentes cepas tienen diferentes eficiencias de transformación, a veces diferentes en tres órdenes de magnitud. Por ejemplo, cuando se transformaron cepas de S. cerevisiae con 10 ug de plásmido YEp13, la cepa DKD-5D-H produjo entre 550 y 3115 colonias, mientras que la cepa OS1 produjo menos de cinco colonias. [54]

Plantas

Hay varios métodos disponibles para transferir ADN a células vegetales. Algunos métodos mediados por vectores son:

Algunos métodos sin vectores incluyen:

Hongos

Existen algunos métodos para producir hongos transgénicos , la mayoría de ellos análogos a los utilizados para las plantas. Sin embargo, los hongos deben tratarse de manera diferente debido a algunas de sus características microscópicas y bioquímicas:

Como se indicó anteriormente, una variedad de métodos utilizados para la transformación de plantas también funcionan en hongos:

animales

La introducción de ADN en células animales suele denominarse transfección y se analiza en el artículo correspondiente.

Aspectos prácticos de la transformación en biología molecular.

El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en bacterias permite que bacterias como Escherichia coli se utilicen como un huésped conveniente para la manipulación del ADN y la expresión de proteínas. Normalmente se utilizan plásmidos para la transformación en E. coli . Para poder mantenerse estable en la célula, una molécula de ADN plásmido debe contener un origen de replicación , que le permita replicarse en la célula independientemente de la replicación del propio cromosoma de la célula.

La eficiencia con la que un cultivo competente puede absorber ADN exógeno y expresar sus genes se conoce como eficiencia de transformación y se mide en unidades formadoras de colonias (ufc) por μg de ADN utilizado. Una eficacia de transformación de 1 x 108 ufc /μg para un plásmido pequeño como pUC19 equivale aproximadamente a 1 entre 2000 moléculas del plásmido utilizado que se transforma.

En la transformación de cloruro de calcio , las células se preparan enfriándolas en presencia de Ca2+
(en CaCl
2solución), haciendo que la célula se vuelva permeable al ADN plasmídico . Las células se incuban en hielo con el ADN y luego se someten a un breve choque térmico (p. ej., a 42 °C durante 30 a 120 segundos). Este método funciona muy bien para ADN plasmídico circular. Las preparaciones no comerciales normalmente deberían dar de 10 6 a 10 7 transformantes por microgramo de plásmido; una preparación deficiente será de alrededor de 10 4 /μg o menos, pero una buena preparación de células competentes puede producir hasta ~10 8 colonias por microgramo de plásmido. [60] Sin embargo, existen protocolos para producir células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación superior a 10 9 . [61] Sin embargo, el método químico generalmente no funciona bien para el ADN lineal, como fragmentos de ADN cromosómico, probablemente porque las enzimas exonucleasas nativas de la célula degradan rápidamente el ADN lineal. Por el contrario, las células que son naturalmente competentes suelen transformarse más eficientemente con ADN lineal que con ADN plasmídico.

La eficiencia de transformación utilizando el CaCl.
2El método disminuye con el tamaño del plásmido y, por lo tanto, la electroporación puede ser un método más eficaz para la absorción de ADN plasmídico grande. [62] Las células utilizadas en la electroporación deben prepararse primero lavándolas en agua fría bidestilada para eliminar las partículas cargadas que pueden crear chispas durante el proceso de electroporación.

Selección y cribado en transformación de plásmidos.

Debido a que la transformación normalmente produce una mezcla de relativamente pocas células transformadas y una gran cantidad de células no transformadas, es necesario un método para seleccionar las células que han adquirido el plásmido. [63] Por lo tanto, el plásmido requiere un marcador seleccionable de modo que aquellas células sin el plásmido puedan morir o detener su crecimiento. La resistencia a los antibióticos es el marcador más utilizado para los procariotas. El plásmido transformador contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico al que, de otro modo, las bacterias serían sensibles. La mezcla de células tratadas se cultiva en medios que contienen el antibiótico para que sólo las células transformadas puedan crecer. Otro método de selección es el uso de ciertos marcadores auxotróficos que pueden compensar la incapacidad de metabolizar ciertos aminoácidos, nucleótidos o azúcares. Este método requiere el uso de cepas adecuadamente mutadas que son deficientes en la síntesis o utilidad de una biomolécula particular, y las células transformadas se cultivan en un medio que permite que solo crezcan las células que contienen el plásmido.

En un experimento de clonación, se puede insertar un gen en un plásmido utilizado para la transformación. Sin embargo, en tal experimento, no todos los plásmidos pueden contener un gen insertado con éxito. Por lo tanto, se pueden emplear técnicas adicionales para detectar células transformadas que contengan plásmido con el inserto. Se pueden utilizar genes indicadores como marcadores , como el gen lacZ que codifica la β-galactosidasa utilizada en la detección azul-blanca . Este método de detección se basa en el principio de complementación α , donde un fragmento del gen lacZ ( lacZα ) en el plásmido puede complementar otro gen lacZ mutante ( lacZΔM15 ) en la célula. Ambos genes por sí solos producen péptidos no funcionales; sin embargo, cuando se expresan juntos, como cuando un plásmido que contiene lacZ-α se transforma en células lacZΔM15 , forman una β-galactosidasa funcional. La presencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse cuando las células se cultivan en placas que contienen X-gal , formando colonias azules características. Sin embargo, el sitio de clonación múltiple , donde un gen de interés puede ligarse al vector plasmídico , se encuentra dentro del gen lacZα . Por lo tanto, la ligadura exitosa altera el gen lacZα y no se puede formar β-galactosidasa funcional, lo que da como resultado colonias blancas. Las células que contienen un inserto ligado con éxito se pueden identificar fácilmente por su coloración blanca de las azules que no lo han logrado.

Otros genes indicadores comúnmente utilizados son la proteína verde fluorescente (GFP), que produce células que brillan en verde bajo luz azul, y la enzima luciferasa , que cataliza una reacción con luciferina para emitir luz. El ADN recombinante también se puede detectar utilizando otros métodos, como la hibridación de ácidos nucleicos con una sonda de ARN radiactiva, mientras que las células que expresaron la proteína deseada del plásmido también se pueden detectar utilizando métodos inmunológicos.

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