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Terapéutica de ARN

Las terapias de ARN son una nueva clase de medicamentos basados ​​en el ácido ribonucleico (ARN) . La investigación ha estado trabajando en el uso clínico desde la década de 1990, con un éxito significativo en la terapia del cáncer a principios de la década de 2010. [1] En 2020 y 2021, se han desarrollado vacunas de ARNm a nivel mundial para su uso en la lucha contra la enfermedad por coronavirus (pandemia de COVID-19). [2] La vacuna de Pfizer-BioNTech contra la COVID-19 fue la primera vacuna de ARNm aprobada por un organismo regulador de medicamentos , seguida por la vacuna de Moderna contra la COVID-19 y otras.

Los principales tipos de terapias de ARN son aquellos basados ​​en ARN mensajero (ARNm), ARN antisentido (ARNas), interferencia de ARN (ARNi) y aptámeros de ARN . De los cuatro tipos, la terapia basada en ARNm es el único tipo que se basa en desencadenar la síntesis de proteínas dentro de las células, lo que la hace particularmente útil en el desarrollo de vacunas. [3] El ARN antisentido es complementario al ARNm codificante y se utiliza para desencadenar la inactivación del ARNm para evitar que el ARNm se use en la traducción de proteínas. [4] Los sistemas basados ​​en ARNi utilizan un mecanismo similar e implican el uso tanto de ARN interferente pequeño (ARNip) como de micro ARN (miARN) para prevenir la traducción del ARNm y/o degradar el ARNm. [5] [6] Sin embargo, los aptámeros de ARN son moléculas de ARN monocatenarias cortas producidas por evolución dirigida para unirse a una variedad de objetivos biomoleculares con alta afinidad, lo que afecta su actividad normal in vivo . [7] [8] [9]

El ARN se sintetiza a partir de ADN molde por la ARN polimerasa, y el ARN mensajero (ARNm) actúa como biomolécula intermediaria entre la expresión del ADN y la traducción de proteínas . Debido a sus propiedades únicas (como su naturaleza típicamente monocatenaria y su grupo 2' OH) y su capacidad para adoptar muchas estructuras secundarias/terciarias diferentes, tanto los ARN codificantes como los no codificantes han atraído la atención en medicina. La investigación ha comenzado a explorar el potencial de los ARN para ser utilizados con fines terapéuticos, y han surgido desafíos únicos durante el descubrimiento de fármacos y la implementación de terapias con ARN. [10]

ARNm

El ARN mensajero ( ARNm ) es una molécula de ARN monocatenario que es complementaria a una de las cadenas de ADN de un gen . [11] Una molécula de ARNm transfiere una porción del código de ADN a otras partes de la célula para fabricar proteínas. [12] Las terapias de ADN necesitan acceso al núcleo para transcribirse en ARN, y su funcionalidad depende de la degradación de la envoltura nuclear durante la división celular. Sin embargo, las terapias de ARNm no necesitan ingresar al núcleo para ser funcionales, ya que se traducirán inmediatamente una vez que hayan llegado al citoplasma . [13] Además, a diferencia de los plásmidos y los vectores virales , los ARNm no se integran en el genoma y, por lo tanto, no tienen el riesgo de mutagénesis insercional , [14] lo que los hace adecuados para su uso en vacunas contra el cáncer, inmunoterapia tumoral y prevención de enfermedades infecciosas. [15]

Descubrimiento y desarrollo

En 1953, Alfred Day Hershey informó que poco después de la infección con fagos , las bacterias producían una forma de ARN a un alto nivel y este ARN también se descomponía rápidamente. [16] Sin embargo, la primera indicación clara de ARNm fue el trabajo de Elliot Volkin y Lazarus Astrachan en 1956 al infectar E. coli con bacteriófagos T2 y ponerlos en el medio con 32 P. [17] [ 18] Descubrieron que la síntesis de proteínas de E. coli se detuvo y se sintetizaron proteínas de fagos. [19] Luego, en mayo de 1961, sus investigadores colaboradores Sydney Brenner, François Jacob y Jim Watson anunciaron el aislamiento del ARNm. [20] [21] Durante algunas décadas después del descubrimiento del ARNm, la gente se centró en comprender los aspectos estructurales, funcionales y de la vía metabólica de los ARNm. Sin embargo, en 1990, Jon A. Wolff demostró la idea de los fármacos codificados por ácidos nucleicos mediante la inyección directa de ARNm transcrito in vitro (IVT) o ADN plasmídico (pDNA) en el músculo esquelético de ratones que expresaban la proteína codificada en el músculo inyectado. [22] [23] [24]

Una vez que el ARNm de IVT llega al citoplasma, se traduce instantáneamente. Por lo tanto, no necesita ingresar al núcleo para ser funcional. [25] Además, no se integra en el genoma y, por lo tanto, no tiene el riesgo de mutagénesis insercional. [26] Además, el ARNm de IVT solo es transitoriamente activo y se degrada completamente a través de vías metabólicas fisiológicas. [27] Debido a estas razones, el ARNm de IVT ha sido objeto de una amplia investigación preclínica.

Mecanismos

La transcripción in vitro (IVT) se realiza en una plantilla de plásmido de ADN linealizado que contiene la secuencia codificante deseada. Luego, el ARNm desnudo o el ARNm complejado en una nanopartícula se administrará sistémica o localmente. Posteriormente, una parte del ARNm desnudo o ARNm complejado exógeno pasará por mecanismos específicos de la célula. Una vez en el citoplasma, el ARNm de IVT es traducido por la maquinaria de síntesis de proteínas. [28] [29]

Existen dos sensores de ARN identificados: los receptores tipo Toll (TLR) y la familia de receptores tipo RIG-I. Los TLR se localizan en el compartimento endosómico de las células, como las células dendríticas y los macrófagos. [30] La familia tipo RIG-I es un receptor de reconocimiento de patrones (PRR). [31] Sin embargo, los mecanismos de respuesta inmunitaria y el proceso de reconocimiento de la vacuna de ARNm por parte de los sensores celulares y el mecanismo de activación de los sensores aún no están claros. [29]

Aplicaciones

Inmunoterapia contra el cáncer

En 1995, Robert Conry demostró que la inyección intramuscular de ARN desnudo que codifica el antígeno carcinoembrionario provocaba respuestas de anticuerpos específicos del antígeno. [32] Luego, se elaboró ​​al demostrar que las células dendríticas (CD) expuestas a ARNm que codifica antígenos específicos o a ARNm total extraído de células tumorales e inyectado en ratones portadores de tumores inducían respuestas inmunes de células T e inhibían el crecimiento de tumores. [33] Luego, los investigadores comenzaron a abordar las CD transfectadas con ARNm utilizando vacunas basadas en CD transfectadas con ARNm IVT ex vivo . [34] Mientras tanto, Argos Therapeutics había iniciado un ensayo clínico de Fase III utilizando CD con carcinoma avanzado de células renales en 2015 (NCT01582672) pero se interrumpió debido a la falta de eficacia. [35]

Para su posterior aplicación, el ARNm de IVT se optimizó para transfecciones in situ de DC in vivo . Mejoró la eficiencia de la traducción y la estabilidad del ARNm de IVT y mejoró la presentación del antígeno codificado por el ARNm en las moléculas de MHC de clase I y II . [36] [37] Luego, descubrieron que la inyección directa de ARNm de IVT desnudo en los ganglios linfáticos era la forma más eficaz de inducir respuestas de células T. [38] Con base en este descubrimiento, BioNTech ha comenzado las primeras pruebas en humanos de la inyección de ARNm de IVT desnudo que codifica antígenos de cáncer con pacientes con melanoma (NCT01684241). [39]

Recientemente, RXi Pharmaceuticals y el Instituto Karolinska inventaron una nueva inmunoterapia contra el cáncer, la combinación de ARN autoadministrado (sd-rxRNA) y la terapia de transferencia celular adoptiva (ACT). En esta terapia, el sd-rxRNA eliminó la expresión de receptores y proteínas inmunosupresores en las células inmunitarias terapéuticas, por lo que mejoró la capacidad de las células inmunitarias para destruir las células tumorales. Luego, el sd-rxRNA dirigido a PD-1 ayudó a aumentar la actividad antitumoral de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) contra las células de melanoma. [40] [41] Basándose en esta idea, el ARNm-4157 se ha probado y ha superado la fase I del ensayo clínico. [42]

Las vías de detección de ácidos nucleicos citosólicos pueden mejorar la respuesta inmunitaria al cáncer. Agonista de RIG-I , ARN de bucle de tallo (SLR) 14. El crecimiento del tumor se retrasó significativamente y prolongó la supervivencia en ratones. SLR14 mejoró la eficacia antitumoral del anticuerpo anti-PD1 sobre el tratamiento con un solo agente. SLR14 fue absorbido por células mieloides CD11b+ en el microambiente tumoral . Los genes asociados con la defensa inmunitaria se regularon positivamente de manera significativa, junto con un aumento de linfocitos T CD8+ , células NK y células CD11b+. SLR14 inhibió el crecimiento tumoral no inmunogénico B16 , dejando memoria inmunitaria. [43]

Vacunas

En 1993, se informó del primer éxito de una vacuna de ARNm en ratones , utilizando ARNm IVT encapsulado en liposomas que codifica la nucleoproteína de la influenza que indujo células T específicas del virus. [44] Luego, el ARNm IVT se formuló con nanopartículas lipídicas sintéticas e indujo respuestas de anticuerpos protectores contra el virus respiratorio sincitial (VSR) y el virus de la influenza en ratones. [45]

Existen varios tipos diferentes de desarrollo de vacunas basadas en ARNm de IVT para enfermedades infecciosas. Uno de los tipos exitosos es el que utiliza ARNm de IVT autoamplificante que tiene secuencias de virus de ARN de cadena positiva. Originalmente se desarrolló para un flavivirus y era viable con inyección intradérmica . Otra de las formas es inyectar una vacuna de dos componentes que contiene un adyuvante de ARNm y ARNm de IVT desnudo que codifica el antígeno de hemaglutinina de influenza solo o en combinación con ARNm de IVT que codifica neuraminidasa . [46]

Por ejemplo, para el tratamiento del VIH, las vacunas utilizan células dendríticas transfectadas con ARNm de IVT que codifica proteínas del VIH. Hay algunos ensayos clínicos de fase I y II que utilizan combinaciones de ARNm de IVT que codifican proteínas del VIH y muestran que se pueden inducir respuestas de células T CD8+ y CD4+ específicas de antígeno. Sin embargo, no se han observado efectos antivirales en el ensayo clínico. [47] [48]

Otra de las vacunas de ARNm es contra la COVID-19 . El coronavirus 2 ( SARS-CoV-2 ) que provocó el síndrome respiratorio agudo severo estalló en diciembre de 2019 y se extendió por todo el mundo, provocando una pandemia de enfermedad respiratoria denominada enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). [49] La vacuna Moderna contra la COVID-19 , fabricada por Moderna desde 2020, es una vacuna basada en ARNm encapsulada en nanopartículas lipídicas (LNP) que codifica un antígeno de SARS-CoV-2 de longitud completa, estabilizado por prefusión, con un anclaje transmembrana . [50] [51]

Antivírico

En 2021, se informó que SLR14 previene la infección en el tracto respiratorio inferior y la enfermedad grave de manera dependiente del interferón tipo I (IFN-I) en ratones. Los ratones inmunodeficientes con infección crónica por SARS-CoV-2 experimentaron una inmunidad innata casi esterilizante sin ayuda del sistema inmunológico adaptativo . [52]

Regeneración tisular

Un estudio de 2022 realizado por investigadores de la Clínica Mayo , la Universidad de Maastricht y Ethris GmBH, una empresa de biotecnología que se centra en la terapia con ARN, descubrió que el ARNm modificado químicamente que codifica BMP-2 promovía la curación dependiente de la dosis de las osteotomías femorales en ratas macho. Las moléculas de ARNm se combinaron dentro de partículas lipídicas no virales , se cargaron en esponjas y se implantaron quirúrgicamente en los defectos óseos. Permanecieron localizadas alrededor del sitio de aplicación. En comparación con la recepción directa de rhBMP-2, los tejidos óseos regenerados después del tratamiento con ARNm mostraron una resistencia superior y una menor formación de callos masivos. [53]

Limitaciones

Existen muchos desafíos para la traducción exitosa de ARNm en fármacos porque el ARNm es una molécula muy grande y pesada (10^5 ~ 10^6 Da). Además, el ARNm es inestable y se degrada fácilmente por las nucleasas, y también activa los sistemas inmunológicos. [54] Además, el ARNm tiene una alta densidad de carga negativa y reduce la permeación del ARNm a través de las membranas celulares. [55] Debido a estas razones, sin el sistema de administración apropiado, el ARNm se degrada fácilmente y la vida media del ARNm sin un sistema de administración es de solo alrededor de 7 horas. [56] Aunque algunos grados de desafíos podrían superarse con modificaciones químicas , la administración de ARNm sigue siendo un obstáculo. Los métodos que se han investigado para mejorar el sistema de administración de ARNm están utilizando microinyección , parches de ARN (ARNm cargado en una microaguja disolvente), pistola genética , condensación de protamina , adyuvantes de ARN y encapsulación de ARNm en nanopartículas con lípidos. [54] [57] [58]

Aunque el ARNm traducido in vitro (IVT) con agentes de administración mostró una resistencia mejorada contra la degradación, se necesitan más estudios sobre cómo mejorar la eficiencia de la administración del ARNm desnudo in vivo . [23]

Terapéutica de ARN aprobada

ARN antisentido

El ARN antisentido es el ARN monocatenario no codificante que es complementario a una secuencia codificante de ARNm. Inhibe la capacidad del ARNm de traducirse en proteínas. [64] Las transcripciones cortas de ARN antisentido se producen dentro del núcleo por la acción de la enzima Dicer, que escinde los precursores de ARN bicatenario en especies de ARN de 21 a 26 nucleótidos de longitud. [4]

Existe una estrategia de descubrimiento basada en antisentido, fundamento y diseño de ensayos de detección, y la aplicación de dichos ensayos para la detección de extractos de productos naturales y el descubrimiento de inhibidores de enzimas de condensación de ácidos grasos . [65] El ARN antisentido se utiliza para tratar el cáncer y la inhibición de la metástasis y vectores para el secuestro de antisentido. En particular, los microARN (miR) 15 y 16 a un paciente que necesita el tratamiento para el diagnóstico y la profilaxis del cáncer. [66] Los fármacos antisentido se basan en el hecho de que el ARN antisentido se hibrida con el ARNm y lo inactiva. Estos fármacos son secuencias cortas de ARN que se unen al ARNm y evitan que un gen particular produzca la proteína para la que codifica. Se están desarrollando fármacos antisentido para tratar el cáncer de pulmón, la diabetes y enfermedades como la artritis y el asma con un componente inflamatorio importante. [67] Se demuestra que la expresión reducida del ARN antisentido 1 de MLLT4 (MLLT4‑AS1) es un biomarcador potencial y un predictor de un mal pronóstico para el cáncer gástrico. Hasta ahora, se han explorado las aplicaciones de los ARN antisentido en tratamientos antivirus y anticancerígenos y en la regulación de la expresión de genes relacionados en plantas y microorganismos. [68] [69]

Se han utilizado vectores no virales, vectores virales y liposomas para administrar el ARN antisentido a través de la membrana celular hacia el citoplasma y el núcleo. [ cita requerida ] Se ha descubierto que la administración basada en vectores virales es la más ventajosa entre los diferentes sistemas de administración porque tiene una alta eficacia de transfección. [70] Sin embargo, es difícil administrar ARN antisentido solo a los sitios objetivo. Además, debido al tamaño y los problemas de estabilidad del ARN antisentido, existen algunas limitaciones para su uso. Para mejorar los problemas de administración, se han estudiado modificaciones químicas y nuevos diseños de oligonucleótidos para mejorar la distribución del fármaco, los efectos secundarios y la tolerabilidad. [71] [72]

ARNi

Los ARN interferentes son una clase de ARN corto, no codificante , que actúan para reprimir la expresión génica de manera traduccional o postraduccional. [73] [5] Su descubrimiento y posterior identificación como efectores clave de la regulación génica postranscripcional han hecho que los ARN interferentes pequeños ( siRNA ) y los micro ARN ( miRNA ) sean terapias potenciales para enfermedades sistémicas. [73] [5] [74] El sistema RNAi fue descubierto originalmente en 1990 por Jorgensen et al., quienes estaban realizando una investigación que involucraba la introducción de genes de coloración en petunias, [74] [75] y se cree que este sistema se desarrolló originalmente como un medio de inmunidad innata contra virus de ARN bicatenario. [76]

ARNi

Un esquema del mecanismo de regulación de genes de ARNi y miARN in vivo.

Los pequeños interferentes ( siRNA ) son fragmentos cortos, de 19-23 pares de bases (con un saliente 3' de dos nucleótidos), de ARN bicatenario que participan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) para el silenciamiento génico. [5] [74] Específicamente, el siRNA se une al complejo RISC donde se desenrolla utilizando hidrólisis de ATP. [74] [77] [78] Luego, la enzima "Slicer" lo utiliza como guía para apuntar a los ARNm para la degradación según el apareamiento de bases complementario al ARNm objetivo. [74] [77] [78] Como terapéutico, el siRNA se puede administrar localmente, a través del ojo o la nariz, para tratar varias enfermedades. [5] La administración local se beneficia de una formulación y administración de fármacos simples y una alta biodisponibilidad del fármaco. [5] La administración sistémica es necesaria para atacar cánceres y otras enfermedades. [5] Dirigir el siRNA cuando se administra localmente es uno de los principales desafíos en la terapéutica del siRNA. [5] Si bien es posible utilizar la inyección intravenosa para administrar terapias de ARNi, se han planteado inquietudes sobre los grandes volúmenes utilizados en la inyección, ya que a menudo deben ser ~20-30% del volumen sanguíneo total. [74] Otros métodos de administración incluyen el empaquetamiento de liposomas, la conjugación con péptidos permeables a la membrana y la electroporación directa de tejidos/órganos . [74] Además, se ha descubierto que los ARNi exógenos solo duran unos pocos días (unas pocas semanas como máximo en células que no se dividen) in vivo . [79] [80] Si el ARNi puede alcanzar con éxito su objetivo, tiene el potencial de regular terapéuticamente la expresión genética a través de su capacidad de aparearse con bases a los objetivos de ARNm y promover su degradación a través del sistema RISC [5] [74] Actualmente, la terapia basada en ARNi se encuentra en un ensayo clínico de fase I para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad , [74] aunque también se está explorando su uso en la terapia del cáncer. Por ejemplo, el ARNi se puede utilizar para atacar a los ARNm que codifican proteínas que promueven el crecimiento tumoral, como el receptor VEGF y la enzima telomerasa . [74]

miARN

Los micro ARN ( miARN ) son oligonucleótidos de ARN cortos, de ~19-23 pares de bases de longitud, que están involucrados en el complejo de silenciamiento inducido por microARN. [74] [6] Específicamente, una vez cargados en la enzima ARGONAUTE , los miARN trabajan con los ARNm para reprimir la traducción y desestabilizar postraduccionalmente el ARNm . [6] Si bien son funcionalmente similares a los ARNi, los miARN no requieren un extenso apareamiento de bases para el silenciamiento del ARNm (pueden requerir tan solo siete pares de bases con el objetivo), [81] [82] lo que les permite afectar ampliamente a una gama más amplia de objetivos de ARNm. [83] En la célula, el miARN utiliza interacciones de cambio, sintonización y neutrales para regular finamente la represión genética. [6] Como terapéutico, el miARN tiene el potencial de afectar las vías bioquímicas en todo el organismo. [73]

Con más de 400 miRNA identificados en humanos, discernir su gen objetivo para la represión es el primer desafío. [6] Se han creado múltiples bases de datos, por ejemplo TargetScan , utilizando la coincidencia de semillas de miRNA. [73] Los ensayos in vitro ayudan a determinar los efectos fenotípicos de los miRNA, [73] pero debido a la naturaleza compleja de la regulación genética, no todos los miRNA identificados tienen el efecto esperado. [6] Además, se ha descubierto que varios miRNA actúan como supresores de tumores u oncogenes in vivo , como el oncogénico miR-155 y miR-17-92. [83]

En los ensayos clínicos , los miRNA se utilizan comúnmente como biomarcadores para una variedad de enfermedades, lo que potencialmente proporciona un diagnóstico más temprano, así como la progresión de la enfermedad, el estadio y los vínculos genéticos. [73] Los ensayos de fase 1 y 2 actualmente prueban imitadores de miRNA (para expresar genes) y miRNA (para reprimir genes) en pacientes con cánceres y otras enfermedades. [73] En particular, los miRNA imitadores se utilizan para introducir miRNA que actúan como supresores de tumores en tejidos cancerosos, mientras que los antagonistas de miRNA se utilizan para dirigirse a miRNA oncogénicos para prevenir su actividad promotora del cáncer. [83] El miRNA terapéutico también se utiliza además de terapias comunes (como terapias contra el cáncer) que se sabe que sobreexpresan o desestabilizan los niveles de miRNA del paciente. [73] Un ejemplo de una terapia con miRNA imitador que demostró eficacia para impedir el crecimiento de tumores de cáncer de pulmón en estudios con ratones es miR-34a. [83] [84]

Un aspecto preocupante de las terapias basadas en miRNA es el potencial de que el miRNA exógeno afecte los mecanismos de silenciamiento de miRNA dentro de las células corporales normales, afectando así las vías bioquímicas celulares normales. [83] Sin embargo, estudios in vivo han indicado que los miRNA muestran poco o ningún efecto en tejidos/órganos no objetivo. [84] [85]

Aptámeros de ARN

Se creó un aptámero de ARN conocido como "Spinach" como herramienta de obtención de imágenes fluorescentes in vivo . [86] Su actividad fluorescente se basa en la unión a 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolidinona (DFHBI). [86]

En términos generales, los aptámeros son moléculas pequeñas compuestas de ADN o ARN monocatenario y suelen tener una longitud de 20 a 100 nucleótidos, [7] [8] [87] o ~3-60 kDa . [87] [88] Debido a su naturaleza monocatenaria, los aptámeros son capaces de formar muchas estructuras secundarias, incluidos pseudonudos , bucles de tallo y protuberancias, a través de interacciones de apareamiento de bases intracatenario. [87] Las combinaciones de estructuras secundarias presentes en un aptámero le confieren una estructura terciaria particular que, a su vez, determina el objetivo específico al que se unirá selectivamente el aptámero. [87] [89] Debido a la capacidad de unión selectiva de los aptámeros, se consideran una biomolécula prometedora para su uso en productos farmacéuticos. [7] [8] [87] Además, los aptámeros exhiben una unión estrecha a los objetivos, con constantes de disociación a menudo en el rango de pM a nM. [7] [9] Además de su fuerte capacidad de unión, los aptámeros también son valorados porque se pueden usar en objetivos que no son capaces de ser unidos por pequeños péptidos generados por visualización de fagos o por anticuerpos , y son capaces de diferenciar entre isómeros conformacionales y sustituciones de aminoácidos . [87] [90] [91] Además, debido a que los aptámeros se basan en ácidos nucleicos, se pueden sintetizar directamente, eliminando la necesidad de expresión y extracción basadas en células como es el caso en la producción de anticuerpos. [8] [92] Los aptámeros de ARN en particular son capaces de producir una miríada de estructuras diferentes, lo que lleva a especulaciones de que son más discriminantes en su afinidad objetivo en comparación con los aptámeros de ADN. [87] [93]

Descubrimiento y desarrollo

Los aptámeros se descubrieron originalmente en 1990 cuando Lary Gold y Craig Tuerk utilizaron un método de evolución dirigida conocido como SELEX para aislar una pequeña molécula de ARN monocatenario que era capaz de unirse a la ADN polimerasa del bacteriófago T4. [8] [94] Además, el término "aptámero" fue acuñado por Andrew Ellington, quien trabajó con Jack Szostak para seleccionar un aptámero de ARN que fuera capaz de unirse firmemente a ciertas moléculas de colorante orgánico. [87] [95] El término en sí es una conglomeración del latín "aptus" o "encajar" y el griego "meros" o "parte". [87] [95]

Los aptámeros de ARN no se “crean” tanto como se “seleccionan”. Para desarrollar un aptámero de ARN capaz de unirse selectivamente a un objetivo molecular, se utiliza un método conocido como Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) para aislar un aptámero de ARN único de un grupo de ~10^13 a 10^16 aptámeros diferentes, también conocido como biblioteca. [7] [8] [87] [94] [95] La biblioteca de oligonucleótidos de aptámeros potenciales se incuba luego con una especie no objetivo para eliminar los aptámeros que exhiben una unión no específica. [7] Después de la eliminación posterior de los aptámeros no específicos, los miembros restantes de la biblioteca se exponen al objetivo deseado, que puede ser una proteína, un péptido, un tipo de célula o incluso un órgano (en el caso de SELEX basado en animales vivos). [7] [87] [96] [97] [98] [99] [100] [101] A partir de ahí, los aptámeros de ARN que se unieron al objetivo se transcriben a ADNc que luego se amplifica a través de PCR , y los productos de PCR se vuelven a transcribir a ARN. [87] Estas nuevas transcripciones de ARN se utilizan luego para repetir el ciclo de selección muchas veces, produciendo así finalmente un grupo homogéneo de aptámeros de ARN capaces de unirse al objetivo de alta afinidad y alta especificidad. [7]

Ejemplos

Los aptámeros de ARN pueden diseñarse para actuar como antagonistas , agonistas o los llamados "aptámeros señuelo de ARN". [87] [102] En el caso de los antagonistas, el aptámero de ARN se utiliza para evitar la unión de una determinada proteína a su receptor de membrana celular o para evitar que la proteína realice su actividad uniéndose al objetivo de la proteína. [87] Actualmente, las únicas terapias basadas en aptámeros de ARN que han avanzado a ensayos clínicos actúan como antagonistas. [87] Cuando los aptámeros de ARN están diseñados para actuar como agonistas, promueven la activación de las células inmunes como una molécula coestimuladora, ayudando así a la movilización del propio sistema de defensa del cuerpo. [87] [103] Para los aptámeros señuelo de ARN, el aptámero de ARN sintético se asemeja a una molécula de ARN nativa. [87] [102] Como tal, las proteínas que se unen al objetivo de ARN nativo se unen al aptámero de ARN, posiblemente interfiriendo con la vía biomolecular de una enfermedad particular. [87] [102] Además de su utilidad como agentes terapéuticos directos, los aptámeros de ARN también se están considerando para otras funciones terapéuticas. Por ejemplo, al conjugar el aptámero de ARN con un compuesto farmacológico, el aptámero de ARN puede actuar como un sistema de administración dirigida para ese fármaco. [7] Estos aptámeros de ARN se conocen como ApDC. [7] Además, a través de la conjugación con un radioisótopo o una molécula de tinte fluorescente , los aptámeros de ARN pueden ser útiles en el diagnóstico por imágenes. [7] [104] [105]

Debido al proceso SELEX utilizado para seleccionar aptámeros de ARN, se pueden generar aptámeros de ARN para muchos objetivos potenciales. Al introducir directamente los aptámeros de ARN en el objetivo durante SELEX, se puede producir un grupo de aptámeros de ARN muy selectivo, de alta afinidad y homogéneo. Como tal, los aptámeros de ARN se pueden hacer para apuntar a pequeños péptidos y proteínas, así como fragmentos de células, células completas e incluso tejidos específicos. [7] [87] [106] [107] [99] [108] Los ejemplos de objetivos moleculares de aptámeros de ARN y objetivos potenciales incluyen factor de crecimiento endotelial vascular , [109] osteoblastos , [110] y ligando de quimiocina CXC 12 ( CXCL2 ). [7] [8] [111]

La estructura química del aptámero de ARN conocido como Pegaptanib , un tratamiento para la degeneración macular relacionada con la edad . [7]

Un ejemplo de una terapia con aptámeros de ARN incluye Pegaptanib (también conocido como Macugen ® ), el único tratamiento con aptámeros de ARN aprobado por la FDA. [7] [8] [87] Aprobado originalmente en 2004 para tratar la degeneración macular relacionada con la edad , Pegaptanib es un aptámero de ARN de 28 nucleótidos que actúa como antagonista del VEGF . [7] [8] [87] Sin embargo, no es tan eficaz como los tratamientos basados ​​en anticuerpos como bevacizumab y ranibizumab . [87] [112] [113] Otro ejemplo de una terapia con aptámeros de ARN es NOX-A12, un aptámero de ARN de 45 nucleótidos que se encuentra en ensayos clínicos para leucemia linfocítica crónica , cáncer de páncreas y otros cánceres. [8] NOX-A12 actúa como antagonista de CXCL12/SDF-1, una quimiocina involucrada en el crecimiento tumoral. [8]

Limitaciones

Si bien la alta selectividad y la unión estrecha de los aptámeros de ARN han generado interés en su uso como productos farmacéuticos, existen muchos problemas que han impedido que tengan éxito in vivo . Por un lado, sin modificaciones, los aptámeros de ARN se degradan después de ser introducidos en el cuerpo por nucleasas en el lapso de unos pocos minutos. [8] [87] [114] [115] Además, debido a su pequeño tamaño, los aptámeros de ARN pueden eliminarse del torrente sanguíneo por el sistema renal. [8] [87] [88] [114] [115] Debido a su carga negativa, se sabe además que los aptámeros de ARN se unen a proteínas en el torrente sanguíneo, lo que conduce a la administración a tejidos no objetivo y a toxicidad. [87] [116] [117] También se debe tener cuidado al aislar los aptámeros de ARN, ya que los aptámeros que contienen secuencias repetidas de citosina-fosfato-guanina (CpG) provocarán la activación del sistema inmunológico a través de la vía del receptor tipo Toll . [8] [118] [119]

Para combatir algunas de las limitaciones in vivo de los aptámeros de ARN, se pueden añadir varias modificaciones a los nucleótidos para ayudar a la eficacia del aptámero. Por ejemplo, se puede unir una fracción de polietilenglicol (PEG) para aumentar el tamaño del aptámero, evitando así su eliminación del torrente sanguíneo por el glomérulo renal . [120] [121] Sin embargo, el PEG se ha visto implicado en reacciones alérgicas durante las pruebas in vivo . [87] [122] [123] Además, se pueden añadir modificaciones para evitar la degradación de la nucleasa, como un grupo fluoro o amino 2', así como una timidina invertida 3'. [8] [87] [124] [125] Además, el aptámero se puede sintetizar de forma que el azúcar ribosa esté en forma L en lugar de forma D , lo que evita aún más el reconocimiento de la nucleasa. [7] [87] [126] [127] Estos aptámeros se conocen como Spiegelmers . [7] [127] Para evitar la activación de la vía del receptor tipo Toll, las nucleobases de citosina dentro del aptámero se pueden metilar. [8] Sin embargo, a pesar de estas posibles soluciones a la eficacia in vivo reducida , es posible que la modificación química del aptámero pueda debilitar su afinidad de unión hacia su objetivo. [87] [128]

Véase también

Referencias

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Enlaces externos

Scholia tiene un perfil para terapias con ARN (Q103741648).