La mayor parte del genoma humano está formado por ADN no codificante de proteínas. [1] Se infiere que dichas secuencias no se emplean comúnmente para codificar una proteína. Sin embargo, aunque estas regiones no codifican proteínas, tienen otras funciones y llevan la información reguladora necesaria. Pueden clasificarse según el tamaño del ARNnc. El ARN no codificante pequeño suele clasificarse como de menos de 200 pb de longitud, mientras que el ARN no codificante largo tiene más de 200 pb. [2] Además, pueden clasificarse por su función dentro de la célula: ARNnc infraestructurales y reguladores. [3] Los ARNnc infraestructurales parecen tener un papel de mantenimiento en la traducción y el empalme e incluyen especies como ARNr, ARNt y ARNsn. Los ARNnc reguladores están involucrados en la modificación de otros ARN.
Los ARN no codificantes largos (LncRNA) son un tipo de ARN que generalmente se define como transcripciones que tienen más de 200 pares de bases de longitud y no se traducen en proteínas. [4] Esta limitación distingue a los lncRNA de los ARN no codificantes pequeños que abarcan microRNA (miRNA), ARN interferentes pequeños (siRNA), ARN que interactúan con Piwi (piRNA), ARN nucleolares pequeños (snoRNA) y otros ARN cortos. [5] Los ARN no codificantes largos incluyen lincRNA, [6] ncRNA intrónicos, [7] ncRNA circulares y lineales. [8]
El ARN no codificante intergénico largo (LincRNA) se define como transcripciones de ARN que tienen más de 200 nucleótidos. Estos ARN no deben tener marcos de lectura abiertos que codifiquen proteínas. El término "intergénico" se refiere a la identificación de estas transcripciones a partir de regiones del genoma que no contienen genes codificadores de proteínas. [9] Los LncRNA también contienen ARN asociados a promotores o potenciadores que son proximales a genes y pueden estar en orientación sentido o antisentido. [9]
Los ARN circulares (CircRNA) son una nueva clase de ARN endógenos no codificantes y se caracterizan por sus estructuras de bucle cerrado covalentemente. Esta clase de ARNnc no tiene una tapa de 5' ni una cola de poli A de 3'. Se ha planteado la hipótesis de que los cirRNA pueden funcionar como posibles marcadores moleculares para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades y desempeñar un papel importante en el inicio y la progresión de enfermedades humanas. [10]
Los ARN pequeños no codificantes (sncRNA) son un tipo de ARN que generalmente se define como transcripciones que tienen una longitud inferior a 200 pares de bases y no se traducen en proteínas. [11] Esta limitación distingue a los sncRNA de los lncRNA . Esta clase incluye, entre otros, microARN (miRNA), ARN pequeños interferentes (siRNA), ARN que interactúan con Piwi (piRNA), ARN nucleolares pequeños (snoRNA) y otros ARN cortos. [5]
Los microARN (miARN) desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica. La mayoría de los miARN se transcriben a partir de secuencias de ADN en miARN primarios. Estos miARN primarios se procesan posteriormente para convertirse en miARN precursores y, finalmente, en miARN maduros. En la mayoría de los casos, los miARN interactúan con la región 3' UTR del ARNm diana para inducir la degradación del ARNm y la represión de la traducción. [12] También se han descrito interacciones de los miARN con otras regiones, incluida la región 5' UTR, la secuencia codificante y los promotores de genes. En determinadas condiciones, los miARN también pueden activar la traducción o regular la transcripción, pero esto depende de factores como la ubicación del efecto. Este proceso de interacción es muy dinámico y depende de múltiples factores. [13] [14]
El ARN ribosómico (ARNr) incluye ARN no codificantes que desempeñan funciones esenciales en la regulación del ARNr. El ARN ribosómico (ARNr) participa en la síntesis de proteínas. Algunas moléculas de ARN actúan catalíticamente, como enzimas de ARN (ribozimas) o participan en la exportación de proteínas. La ribozima más importante es el ARNr principal de la subunidad grande del ribosoma (ARNr 28s en eucariotas). Actualmente se acepta que el ARNr 28S cataliza el paso crítico en la síntesis de polipéptidos, además de desempeñar una función estructural importante. [15]
Se sabe ampliamente que el ARN nuclear pequeño (snRNA) y el ARN nucleolar pequeño (snoRNA) guían las modificaciones de nucleótidos y el procesamiento del ARNr. [16] [17] Tanto el snRNA como el snoRNA se clasifican en una clase de moléculas de ARN pequeñas que están presentes en el núcleo. Sin embargo, varían mucho según la función. El snRNA tiene una longitud de 80 a 350 nucleótidos, mientras que el snoRNA tiene una longitud de 80 a 1000 nucleótidos en la levadura. El snRNA juega un papel crítico en la regulación del silenciamiento del pre-ARNm. Por otro lado, los snoRNA están involucrados en la edición del ARNm, la modificación del ARNr y el ARNt y la impronta genómica. La función principal del snoRNA incluye la maduración del ARNr durante la formación ribosómica. Los ARN nucleares pequeños y nucleolares pequeños son componentes críticos de los snRNP y snoRNP y desempeñan un papel esencial en la maduración de, respectivamente, los ARNm y los ARNr dentro del núcleo de las células eucariotas. [18] Tanto el snRNA como el snoRNA participan en la modificación del ARN justo después de la transcripción. El snRNA se puede encontrar en las motas de empalme y los cuerpos de Cajal del núcleo de la célula. El snRNA y el snoRNA requieren un adaptador fosforilado para la exportación nuclear (PHAX) para ser transportados al sitio de acción dentro del núcleo.
El ARN de transferencia (ARNt) ayuda a decodificar una secuencia de ARN mensajero en una proteína. Funciona en sitios específicos dentro del ribosoma durante la traducción (el proceso que va del código a la proteína). Dentro de la molécula de ARNm tenemos codones de tres nucleótidos de longitud. Todos estos codones tienen un código universal único que representa un aminoácido en particular. Los ARNt se pueden clasificar como una molécula adaptadora, ya que normalmente tienen entre 76 y 90 nucleótidos de longitud. [19] [20] [21]
La purificación del ADN realizada en 1869 por el Dr. Friedrich Miescher a partir de esperma de salmón y células de pus guió a los científicos hacia la presencia de moléculas adicionales en la célula, además de proteínas. Miescher identificó la presencia de una molécula altamente ácida que aisló de las células de pus y la denominó “nucleína”. El término fue acuñado porque el ADN aislado por Miescher no era proteína y se derivaba del núcleo de la célula. [22] No fue hasta 1944, cuando Oswald Avery propuso el ADN como portador genético de información, que el descubrimiento de Miescher salió a la luz. [23]
La cristalografía de rayos X, realizada por Rosalind Franklin, y la determinación de la doble hélice del ADN por Watson y Crick en 1953, mejoraron aún más la comprensión de la estructura del ADN y permitieron el establecimiento del dogma central de la biología molecular. Sin embargo, uno de los defectos del dogma central era la postulación de que el flujo de información procede del ADN al ARN y a la proteína, lo que dificulta la comprensión de los diferentes mecanismos reguladores. [24]
En 1955, George Palade identificó el primer ncRNA como parte del complejo ribonucleoproteico grande (RNP). La segunda clase de ncRNA que se descubrió fue el ARN de transferencia (ARNt) en 1957. Sin embargo, el primer ncRNA regulador fue un microRNA descubierto en 1988 a partir de E. coli y fue etiquetado como micF . [25] Por otro lado, el primer microRNA eucariota fue descubierto en C. elegans en 1993. Se derivó del gen lin-4 y se identificó como una pequeña molécula de ARN (en comparación con moléculas de ARNm más largas) que forma estructuras de tallo-bucle. Esta estructura se modifica aún más para generar un ARN más corto que es complementario a la región 3'UTR de la transcripción lin-14. [26] Esta vía permitió una mejor comprensión de diferentes vías de silenciamiento génico postraduccional. Desde entonces, se han descubierto muchos otros miRNA.
En 2001, Thomas Tuschl logró una comprensión detallada del mecanismo que se esconde detrás de esta vía de silenciamiento postraduccional. Se descubrió que el ARN bicatenario se procesa en un fragmento más corto de 25 nucleótidos de longitud que luego se modifica en una estructura corta similar a una horquilla mediante el complejo Drosha. Luego, las enzimas Dicer cortan la molécula en un ARN bicatenario funcional (dsRNA). Luego, estos se cargan en el complejo RISC, que luego encuentra y corta el ARNm de interés en el citoplasma. [27]
No fue hasta 1989 que se descubrieron los genes de impronta y se estableció la impronta genómica. Los dos primeros genes de impronta genómica fueron Igf2r expresados paternalmente [28] y H19 . [29] Ambos se descubrieron de forma independiente en ratones y se localizaron en el cromosoma 7. H19 es peculiar, ya que funciona como un lncRNA pero sufre modificaciones similares a las del procesamiento del pre-ARNm, como el empalme, la poliadenilación 3' y es transcrito por la ARN polimerasa II. Este lncRNA desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario de los ratones y puede ser letal si se expresa durante las etapas prenatales. Con el tiempo, se han descubierto más lncRNA en eucariotas. Uno de esos descubrimientos que permitió una mejor comprensión entre las funciones de H19 fue un lncRNA llamado XIST (transcripción específica inactiva de X). [30]
El primer fármaco terapéutico ncRNA aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) (1998) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) (1999) se llama Fomivirsen o Vitravene. El órgano diana es el ojo y actúa contra la retinitis por citomegalovirus (CMV) en pacientes inmunodeprimidos. [31] El fármaco funciona como un oligonucleótido antisentido y se une a la secuencia complementaria del ARNm que inhibe la replicación del citomegalovirus humano. Esta terapia también se puede clasificar como terapia de oligonucleótido antisentido (ASO). [32] Ha habido muchas terapias de ARN ASO que han sido aprobadas por la FDA y/o la EMA a lo largo de los años, pero no fue hasta 2018 que la EMA aprobó el fármaco llamado Patisiran/Onpattro. [33] El fármaco utiliza ds-siRNA como mecanismo de acción y se considera eficaz contra la amiloidosis hereditaria por transtiretina. El mecanismo se dirige específicamente al ARNm de la transtiretina (TTR). Los objetivos terapéuticos del ARN no se limitan al ARNm maduro, sino que se han utilizado para atacar al ARNm en diferentes etapas de maduración. Un ejemplo de ello es Nusinersen (Spinaraza), que funciona como un ASO y se dirige al pre-ARNm antes del empalme que corresponde al gen de supervivencia de la neurona motora 2 (SMN 2). [34] Esta terapia farmacológica fue aprobada por la FDA y la EMA en 2016 y 2017 respectivamente. Hay algunos medicamentos que han sido aprobados por la FDA y no por la EMA. Esto se puede ver en el caso de una terapia de tipo ASO llamada Eteplirsen (Exondys51) que ha sido aprobada por la FDA en 2016 pero no por la EMA. Se dirige al pre-ARNm correspondiente a la distrofina (DMD) y actúa contra la distrofia muscular de Duchenne. [35] Hay muchas terapias adicionales que se han desarrollado y están en la fase I o II de los ensayos clínicos. Las terapias actuales con ARN que se encuentran en ensayos clínicos abarcan una variedad de órganos y enfermedades objetivo que van desde la piel (tratamiento potencial para enfermedades como los queloides) hasta tumores (cáncer de pulmón de células escamosas).
Hasta la fecha, tanto para la FDA como para la EMA, los ncRNAs se consideran productos médicos “simples” debido a su producción por síntesis química. Cuando algunos de ellos, producidos biológicamente (conocidos como agentes ncRNA bioingeniería: BERAs), se pongan en el mercado, se les aplicará el estatus de productos médicos biológicos, lo que podría dar lugar a inconsistencias en la legislación. [36]
Los oligonucleótidos antisentido (ASO) son moléculas de ADN monocatenario con complementariedad total con un ARNm diana seleccionado [37] y pueden actuar bloqueando la traducción de proteínas (a través de impedimento estérico), causando la degradación del ARNm (a través de la escisión de la ARNasa H) o modificando el empalme del pre-ARNm. [38] Estos oligonucleótidos cortos ya han sido aprobados por la FDA para diez trastornos genéticos y muchos de ellos están actualmente en proceso de aprobación/prueba. Mediante el uso de la tecnología de oligonucleótidos, ahora podemos controlar la expresión de proteínas a través de la interferencia del ARN y podemos afectar a proteínas previamente definidas como “no farmacológicas”. Si bien esta terapia es muy prometedora y tiene mucho potencial, tiene muchas limitaciones. [38]
En comparación con el ARNi y el microARN, los ASO son más versátiles a la hora de reducir la expresión de proteínas y tienen la capacidad de mejorar también la traducción del objetivo. Los ASO también se pueden personalizar con facilidad y precisión, lo que permite la focalización de prácticamente cualquier gen mutado. Esto permite un mayor nivel de aplicación en el campo de la medicina de precisión y personalizada. [38] El principal desafío de las terapias ASO para tejidos específicos y la captación celular es lo que plantea un gran desafío y limitación. La administración liposomal es una de esas formas de superar estos problemas. El sistema de administración liposomal viene con su propia cuota de limitaciones. Las proteínas séricas en el torrente sanguíneo desestabilizan la lipoproteína. Esta desestabilización conduce al agotamiento de la proteína y a la exposición de la carga al entorno inestable. Este obstáculo se puede superar utilizando PEG (polietilenglicol). Sin embargo, los PEG no son biodegradables, lo que hace que se acumulen dentro del cuerpo, lo que produce efectos adversos y provoca hipersensibilidad. Además, varias rondas de terapia con PEG pueden provocar la formación de anticuerpos contra PEG, lo que puede provocar una falta de eficacia a la hora de prevenir la ruptura del liposoma al que está adherido. [38] Se ha demostrado que utilizando inmunoliposomas la focalización puede ser más específica, ya que al utilizar anticuerpos específicos para la proteína de expresión en esa zona, el fármaco ASO impacta directamente en el sitio diana y en ningún otro lugar. Además, los inmunoliposomas tardan en disociarse, lo que produce una liberación precisa del fármaco ASO que encapsulan. [38] [39]
Los ARN no codificantes largos (lncRNA) son transcripciones grandes (de más de 200 nucleótidos de longitud) que tienen un mecanismo de síntesis similar al de los ARNm, pero a diferencia de estos, los lncRNA no se traducen en una proteína. El lncRNA contiene elementos interactores y elementos estructurales. Los elementos interactores interactúan directamente con otros ácidos nucleicos o proteínas, mientras que los elementos estructurales indican la capacidad de algunos lncRNA de formar estructuras secundarias y/o terciarias. Esta capacidad de los lncRNA de interactuar con ácidos nucleicos utilizando sus elementos interactores y su capacidad de interactuar con proteínas utilizando sus estructuras secundarias le permite funcionar de una manera más diversa que otros ncRNA como los miRNA (microRNA). Se ha establecido que el lncRNA desempeña un papel en la regulación genética al influir en la capacidad de regiones específicas del gen de unirse a elementos transcripcionales y diferentes modificaciones epigenéticas. Un ejemplo de ello se puede ver en el caso de la transcripción específica inactiva X (XIST). En los seres humanos, las mujeres 46,XX tienen un cromosoma X adicional (155 Mb de ADN) en comparación con los hombres 46,XY. Para superar este desequilibrio de dosis, un cromosoma X se inactiva aleatoriamente en las mujeres humanas alrededor de la etapa de desarrollo embrionario de 2 a 8 células. Esta inactivación es muy estable a lo largo de las divisiones celulares debido a las contribuciones epigenéticas tanto durante el silenciamiento inicial como durante el mantenimiento posterior del cromosoma X inactivo (Xi). Esta inactivación es llevada a cabo por el lncRNA, XIST. XIST se produce en cis e inactiva el cromosoma X del que se ha generado. El cromosoma X inactivo se puede observar como una estructura de heterocromatina condensada llamada "Cuerpo de Barr". [40] Un estudio de 2013 utilizó esta capacidad de XIST como un posible enfoque terapéutico para el tratamiento de la trisomía 21. [41] La trisomía 21 se conoce comúnmente como síndrome de Down y es causada por la presencia de una copia adicional del cromosoma 21. El estudio fue único en su tipo, ya que ningún otro estudio ha podido incorporar el gen XIST en un cromosoma debido a su gran tamaño. El estudio incorporó el XIST en uno de los cromosomas 21 en las células recolectadas de pacientes con síndrome de Down. El estudio pudo observar la inactivación de uno de los cromosomas 21 en forma de heterocromatina condensada y lo etiquetó como un cuerpo de barra del cromosoma 21. Se ha demostrado que estos experimentos funcionan en células en el entorno de laboratorio, aunque no hay terapias basadas en lncRNA en ensayos clínicos. Las implicaciones de este trabajo pueden llevar la trisomía 21 y otros trastornos cromosómicos al ámbito de la consideración para futuras investigaciones de terapia génica. [41]
Uno de los principales problemas que dificultan la terapia con ARNnc es la estabilidad de la molécula de ARN monocatenario. El ARN es típicamente monocatenario, por lo tanto, ligeramente inestable en comparación con las moléculas de ADNdc. Sin embargo, esto se puede superar fabricando el ARN monocatenario en ARN bicatenario (ARNdc). Esto es bastante eficaz ya que el ARNdc es más estable a temperatura ambiente y tiene una vida útil más larga. El segundo problema importante es la orientación específica de las moléculas de ARN a células/tejidos/órganos. Generalmente, esto se supera conteniendo el ARNdc en una nanopartícula lipídica y usándola como ligando para unirse a un receptor en la superficie de la célula objetivo. Las partículas lipídicas son llevadas a las células del hígado a través de sus receptores específicos y este mecanismo parece ser eficaz para dirigirse a las células del hígado/cáncer. [42] Otro órgano con un mecanismo de administración relativamente fácil es el ojo. Esto requiere una técnica invasiva de inyectar directamente el ARNnc de interés directamente en el ojo. Estas técnicas no solo son invasivas, sino que tampoco garantizan que todas las células del órgano diana sean el objetivo del ncRNA de interés. Surgen problemas adicionales una vez que la molécula de ARN entra en la célula. Uno de los problemas es el sistema inmunológico. Nuestro sistema inmunológico puede reconocer el ARN utilizando los receptores intracelulares de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y los receptores extracelulares tipo Toll (TLR). La activación de los receptores conduce a una respuesta inmune mediada por citocinas (IFNy-Interferón gamma). Las aplicaciones comunes para superar la respuesta inmune incluyen modificaciones químicas de segunda generación. Este proceso incluye la introducción de pequeñas modificaciones químicas de una en una para evitar la respuesta inmune. Sin embargo, hay algunos informes de respuestas inmunes adversas en ensayos clínicos que emplean dichos reactivos modificados. [43] No hay una respuesta fija a los problemas con la inmunogenicidad y la terapia con ncRNA. Los vectores de adenovirus modificados se han utilizado ampliamente en muchos ensayos clínicos como un mecanismo de administración de ncRNA. [44] En particular, el vector de adenovirus se considera un sistema de administración eficiente debido a su estabilidad dentro de las células vivas y su no patogenicidad. [45] Aunque las transfecciones virales han logrado resultados significativos en la investigación básica, uno de los problemas es la falta de especificidad que conduce a transfecciones fuera del objetivo. Es necesario realizar más investigaciones para mejorar la precisión de las transfecciones virales para futuras pruebas y ensayos clínicos.
En diciembre de 2021, la FDA elaboró un borrador de guía para el uso de productos farmacéuticos ASO . Este borrador de guía estaba dirigido a los investigadores patrocinadores que están desarrollando productos farmacéuticos de oligonucleótidos antisentido (ASO) en investigación individualizados para enfermedades gravemente debilitantes o potencialmente mortales. Gravemente debilitante corresponde a una enfermedad o afección que causa una morbilidad irreversible importante. Sin embargo, potencialmente mortal se define como una enfermedad o afección que tiene una probabilidad de muerte a menos que el curso del tratamiento conduzca a un punto final de supervivencia. Por lo general, las personas que padecen una enfermedad gravemente debilitante y potencialmente mortal no tienen ninguna opción de tratamiento alternativa y sus enfermedades progresarán rápidamente, lo que provocará una muerte temprana y/o una morbilidad devastadora o irreversible en un corto período de tiempo sin tratamiento.
El desarrollo de fármacos suele estar dirigido a un gran número de personas, en este caso eso no es posible debido a la especificidad del mecanismo de acción del ASO combinado con la rareza de la población de pacientes susceptibles de tratamiento. Según las normas de la FDA, un protocolo según el cual se administra un producto ASO individual a un sujeto humano debe ser revisado y aprobado por una junta de revisión institucional (IRB) antes de que pueda administrarse a sujetos humanos. Cuando el individuo es un niño, se deben identificar salvaguardas adicionales para evitar que se produzcan problemas de desarrollo que puedan afectar la vida del individuo. El patrocinador-investigador debe obtener el consentimiento informado del individuo o de la persona que es responsable del individuo. El consentimiento debe incluir una descripción de los riesgos o molestias razonablemente previsibles como parte del uso del fármaco ASO. El patrocinador también debe obtener el diagnóstico clínico y genético de los individuos para confirmar que el ASO será beneficioso. El análisis puede realizarse mediante secuenciación genética , análisis enzimático , pruebas bioquímicas, evaluaciones de imágenes. Todos los resultados deben incluirse en la solicitud. Además, el patrocinador debe incluir pruebas que establezcan el papel de la variante genética a la que se dirige el fármaco ASO. El patrocinador/investigador también debe proporcionar pruebas de que la variante o variantes genéticas identificadas son exclusivas del individuo.
La guía sugiere que la dosis inicial debe basarse en datos no clínicos disponibles que se hayan recopilado de organismos modelo o estudios in vitro y debe estar en correlación con otra información de dosificación de medicamentos ASO disponible. En la dosis inicial, se esperan efectos farmacológicos. Además, se recomienda que se utilice un método de escalada de dosis. Esto incluye el paso de escalar la dosis inicial de la droga en función de los efectos farmacodinámicos y/o la respuesta de los participantes del ensayo al ASO.
Además, los protocolos presentados ante la FDA deben incluir un plan de dosificación claro y una justificación para seleccionar la dosis inicial, el intervalo de dosificación y un plan de aumento o reducción de la dosis en función de los efectos farmacodinámicos clínicos del fármaco en el individuo. Además, todos los resultados previstos deben incluirse en el plan de dosificación cuando se presenta a la FDA. Es extremadamente importante que los investigadores controlen de cerca al paciente durante el aumento de la dosis . Durante el período de aumento, se debe proporcionar tiempo adecuado para ver los resultados terapéuticos. Se recomienda que el investigador no realice cambios concurrentes en el intervalo de dosificación junto con la dosis sin justificación. El plan presentado debe incluir un plan de desescalada/interrupción si se observa toxicidad. Toda administración de medicamentos debe realizarse en un entorno hospitalario solo para comprender los efectos adversos que puede tener el medicamento. Una vez que se identifican la toxicidad, los beneficios y los efectos adversos del medicamento, el medicamento se puede administrar de manera ambulatoria siempre que se administre la misma concentración de medicamento. [46]