La cromatografía líquida de alto rendimiento ( HPLC ), anteriormente denominada cromatografía líquida de alta presión , es una técnica de química analítica que se utiliza para separar, identificar y cuantificar componentes específicos en mezclas. Las mezclas pueden provenir de alimentos , químicos , farmacéuticos , [1] biológicos , ambientales y agrícolas , etc, que han sido disueltos en soluciones líquidas.
Se basa en bombas de alta presión, que suministran mezclas de varios disolventes, llamada fase móvil , que fluye a través del sistema, recogiendo la mezcla de muestra en el camino y entregándola a un cilindro, llamado columna, lleno de partículas sólidas, hecho de Material adsorbente , llamado fase estacionaria .
Cada componente de la muestra interactúa de manera diferente con el material adsorbente, lo que provoca diferentes tasas de migración para cada componente. Estas diferentes velocidades conducen a la separación a medida que las especies fluyen fuera de la columna hacia un detector específico , como los detectores UV . La salida del detector es un gráfico, llamado cromatograma. Los cromatogramas son representaciones gráficas de la intensidad de la señal versus el tiempo o el volumen, mostrando picos que representan componentes de la muestra. Cada muestra aparece en su respectivo tiempo, llamado tiempo de retención, teniendo un área proporcional a su cantidad.
La HPLC se utiliza ampliamente para la fabricación ( p. ej ., durante el proceso de producción de productos farmacéuticos y biológicos), [2] [3] legal ( p. ej. , detección de fármacos que mejoran el rendimiento en la orina), [4] investigación ( p. ej. , separación de los componentes de un muestra biológica compleja o de sustancias químicas sintéticas similares entre sí) y con fines médicos ( p. ej. , detectar niveles de vitamina D en el suero sanguíneo). [5]
La cromatografía puede describirse como un proceso de transferencia de masa que implica adsorción y/o partición . Como se mencionó, la HPLC se basa en bombas para hacer pasar un líquido presurizado y una mezcla de muestra a través de una columna llena de adsorbente, lo que lleva a la separación de los componentes de la muestra. El componente activo de la columna, el adsorbente, suele ser un material granular hecho de partículas sólidas ( p. ej ., sílice , polímeros, etc.), de 1,5 a 50 µm de tamaño, sobre las que se pueden unir varios reactivos. Los componentes de la mezcla de muestra se separan entre sí debido a sus diferentes grados de interacción con las partículas adsorbentes. El líquido presurizado suele ser una mezcla de disolventes ( por ejemplo , agua, tampones , acetonitrilo y/o metanol ) y se denomina "fase móvil". Su composición y temperatura juegan un papel importante en el proceso de separación al influir en las interacciones que tienen lugar entre los componentes de la muestra y el adsorbente. Estas interacciones son de naturaleza física, como hidrofóbicas (dispersivas), dipolo-dipolo e iónicas, generalmente una combinación.
El cromatógrafo líquido es complejo [6] y cuenta con una tecnología sofisticada y delicada. Para poder operar correctamente el sistema, debe haber una base mínima para comprender cómo el dispositivo realiza el procesamiento de datos para evitar datos incorrectos y resultados distorsionados. [7] [8] [9]
La HPLC se distingue de la cromatografía líquida tradicional ("baja presión") porque las presiones operativas son significativamente más altas (alrededor de 50 a 1400 bar), mientras que la cromatografía líquida ordinaria generalmente depende de la fuerza de la gravedad para hacer pasar la fase móvil a través de la columna empaquetada. Debido a la pequeña cantidad de muestra separada en HPLC analítica, las dimensiones típicas de la columna son de 2,1 a 4,6 mm de diámetro y de 30 a 250 mm de longitud. Además, las columnas de HPLC se fabrican con partículas adsorbentes más pequeñas (de 1,5 a 50 μm de tamaño medio de partícula). Esto le da a la HPLC un poder de resolución superior (la capacidad de distinguir entre compuestos) al separar mezclas, lo que la convierte en una técnica cromatográfica popular.
El esquema de un instrumento de HPLC normalmente incluye depósitos de disolventes, una o más bombas, un desgasificador de disolventes , un muestreador, una columna y un detector. Los solventes se preparan con anticipación de acuerdo con las necesidades de la separación, pasan a través del desgasificador para eliminar los gases disueltos, se mezclan para convertirse en la fase móvil, luego fluyen a través del muestreador, que lleva la mezcla de muestra a la corriente de fase móvil, que luego lo lleva a la columna. Las bombas suministran el flujo y la composición deseados de la fase móvil a través de la fase estacionaria dentro de la columna y luego directamente a una celda de flujo dentro del detector. El detector genera una señal proporcional a la cantidad de componente de muestra que emerge de la columna, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes de la muestra. El detector también marca el momento de aparición, el tiempo de retención, que sirve para la identificación inicial del componente. Los detectores más avanzados también proporcionan información adicional, específica de las características del analito, como el espectro UV-VIS o el espectro de masas , que pueden proporcionar información sobre sus características estructurales. Estos detectores son de uso común, como UV/Vis, detector de matriz de fotodiodos (PDA)/ matriz de diodos y detector de espectrometría de masas .
Un microprocesador digital y un software de usuario controlan el instrumento HPLC y proporcionan análisis de datos. Algunos modelos de bombas mecánicas en un instrumento de HPLC pueden mezclar varios disolventes en proporciones que cambian con el tiempo, generando un gradiente de composición en la fase móvil. La mayoría de los instrumentos de HPLC también tienen un horno de columna que permite ajustar la temperatura a la que se realiza la separación.
La mezcla de muestra que se va a separar y analizar se introduce, en un pequeño volumen discreto (normalmente microlitros), en la corriente de fase móvil que se filtra a través de la columna. Los componentes de la muestra se mueven a través de la columna, cada uno a una velocidad diferente, que son función de interacciones físicas específicas con el adsorbente, la fase estacionaria. La velocidad de cada componente depende de su naturaleza química, de la naturaleza de la fase estacionaria (dentro de la columna) y de la composición de la fase móvil. El momento en el que un analito específico eluye (emerge de la columna) se denomina tiempo de retención. El tiempo de retención, medido en condiciones particulares, es una característica identificativa de un analito determinado.
Hay muchos tipos diferentes de columnas disponibles, llenas de adsorbentes que varían en tamaño de partícula, porosidad y química de superficie. El uso de materiales de empaque de tamaño de partículas más pequeño requiere el uso de una presión operativa más alta ("contrapresión") y generalmente mejora la resolución cromatográfica (el grado de separación de picos entre analitos consecutivos que emergen de la columna). Las partículas absorbentes pueden ser de naturaleza iónica, hidrofóbica o polar.
El modo más común de cromatografía líquida es la fase reversa , donde las fases móviles utilizadas incluyen cualquier combinación miscible de agua o tampones con varios disolventes orgánicos (los más comunes son acetonitrilo y metanol). Algunas técnicas de HPLC utilizan fases móviles sin agua (consulte la cromatografía en fase normal a continuación). El componente acuoso de la fase móvil puede contener ácidos (como ácido fórmico, fosfórico o trifluoroacético ) o sales para ayudar en la separación de los componentes de la muestra. La composición de la fase móvil puede mantenerse constante ("modo de elución isocrática") o variar ("modo de elución en gradiente") durante el análisis cromatográfico. La elución isocrática suele ser eficaz en la separación de mezclas simples. Se requiere elución en gradiente para mezclas complejas, con interacciones variables con las fases estacionaria y móvil. Esta es la razón por la cual en la elución en gradiente la composición de la fase móvil varía típicamente de baja a alta fuerza de elución. La fuerza de elución de la fase móvil se refleja en los tiempos de retención del analito, ya que la alta fuerza de elución acelera la elución (lo que da como resultado un acortamiento de los tiempos de retención). Por ejemplo, un perfil de gradiente típico en cromatografía de fase reversa podría comenzar con un 5 % de acetonitrilo (en agua o tampón acuoso) y progresar linealmente hasta un 95 % de acetonitrilo durante 5 a 25 minutos. Los períodos de composición constante de la fase móvil (meseta) también pueden ser parte de un perfil de gradiente. Por ejemplo, la composición de la fase móvil se puede mantener constante al 5% de acetonitrilo durante 1 a 3 minutos, seguido de un cambio lineal hasta el 95% de acetonitrilo.
La composición elegida de la fase móvil depende de la intensidad de las interacciones entre varios componentes de la muestra ("analitos") y la fase estacionaria ( p. ej ., interacciones hidrófobas en HPLC de fase reversa). Dependiendo de su afinidad por las fases estacionaria y móvil, los analitos se dividen entre las dos durante el proceso de separación que tiene lugar en la columna. Este proceso de partición es similar al que ocurre durante una extracción líquido-líquido , pero es continuo, no escalonado.
En el ejemplo que utiliza un gradiente de agua/acetonitrilo, los componentes más hidrófobos eluirán ( saldrán de la columna) más tarde, luego, una vez que la fase móvil se vuelve más rica en acetonitrilo ( es decir , en una fase móvil se vuelve una solución de elución más alta), sus velocidades de elución arriba.
La elección de los componentes de la fase móvil, los aditivos (como sales o ácidos) y las condiciones del gradiente depende de la naturaleza de la columna y de los componentes de la muestra. A menudo se realiza una serie de pruebas con la muestra para encontrar el método de HPLC que proporcione una separación adecuada.
Antes de la HPLC, los científicos utilizaban técnicas de cromatografía líquida en columna de mesa. Los sistemas de cromatografía líquida eran en gran medida ineficientes debido a que el caudal de los disolventes dependía de la gravedad. Las separaciones tardaron muchas horas y, a veces, días en completarse. La cromatografía de gases (GC) en ese momento era más poderosa que la cromatografía líquida (LC); sin embargo, era obvio que la separación en fase gaseosa y el análisis de biopolímeros muy polares de alto peso molecular era imposible. [10] La GC fue ineficaz para muchas aplicaciones de biomoléculas en ciencias biológicas y salud, porque en su mayoría son no volátiles y térmicamente inestables a las altas temperaturas de la GC. [11] Como resultado, se plantearon la hipótesis de métodos alternativos que pronto darían como resultado el desarrollo de HPLC.
Siguiendo el trabajo fundamental de Martin y Synge en 1941, Calvin Giddings , [12] Josef Huber y otros predijeron en la década de 1960 que el LC podría funcionar en el modo de alta eficiencia reduciendo el diámetro de las partículas de empaque sustancialmente por debajo. el nivel típico de LC (y GC) de 150 μm y usando presión para aumentar la velocidad de la fase móvil. [10] Estas predicciones fueron objeto de una extensa experimentación y refinamiento a lo largo de los años 60 y 70 hasta nuestros días. [13] Las primeras investigaciones sobre el desarrollo comenzaron a mejorar las partículas de LC, por ejemplo el histórico Zipax, una partícula superficialmente porosa. [14]
La década de 1970 trajo consigo muchos avances en hardware e instrumentación. Los investigadores comenzaron a utilizar bombas e inyectores para realizar un diseño rudimentario de un sistema HPLC. [15] Las bombas amplificadoras de gas eran ideales porque operaban a presión constante y no requerían sellos sin fugas ni válvulas de retención para un flujo constante y una buena cuantificación. [11] Se lograron hitos en materia de hardware en Dupont IPD (División de Polímeros Industriales), como la utilización de un dispositivo de gradiente de bajo volumen de permanencia y la sustitución del inyector de tabique por una válvula de inyección de bucle. [11]
Si bien los desarrollos en instrumentación fueron importantes, la historia del HPLC trata principalmente sobre la historia y la evolución de la tecnología de partículas . [11] [16] Después de la introducción de partículas de capas porosas, ha habido una tendencia constante a reducir el tamaño de las partículas para mejorar la eficiencia. [11] Sin embargo, al disminuir el tamaño de las partículas, surgieron nuevos problemas. Las desventajas prácticas surgen de la excesiva caída de presión necesaria para forzar el fluido móvil a través de la columna y la dificultad de preparar un empaque uniforme de materiales extremadamente finos. [17] Cada vez que el tamaño de las partículas se reduce significativamente, generalmente debe ocurrir otra ronda de desarrollo de instrumentos para manejar la presión. [13] [11]
La cromatografía de partición fue uno de los primeros tipos de cromatografía que desarrollaron los químicos y apenas se utiliza en la actualidad. [18] El principio del coeficiente de partición se ha aplicado en aplicaciones de cromatografía en papel , cromatografía en capa fina , fase gaseosa y separación líquido-líquido . El Premio Nobel de Química de 1952 lo obtuvieron Archer John Porter Martin y Richard Laurence Millington Synge por el desarrollo de la técnica, que se utilizó para la separación de aminoácidos . [19] La cromatografía de partición utiliza un disolvente retenido, en la superficie o dentro de los granos o fibras de una matriz de soporte sólida "inerte", como ocurre con la cromatografía en papel; o aprovecha alguna interacción coulómbica y/o donante de hidrógeno con la fase estacionaria. Las moléculas de analito se dividen entre una fase estacionaria líquida y el eluyente. Al igual que en la cromatografía de interacción hidrófila (HILIC; una subtécnica dentro de HPLC), este método separa los analitos en función de las diferencias en su polaridad. HILIC utiliza con mayor frecuencia una fase estacionaria polar unida y una fase móvil hecha principalmente de acetonitrilo con agua como componente fuerte. La HPLC de partición se ha utilizado históricamente en soportes de sílice o alúmina no adheridos. Cada uno funciona eficazmente para separar analitos por diferencias polares relativas. Las fases unidas por HILIC tienen la ventaja de separar solutos ácidos , básicos y neutros en una sola serie cromatográfica. [20]
Los analitos polares se difunden en una capa de agua estacionaria asociada con la fase estacionaria polar y, por tanto, son retenidos. Cuanto más fuertes sean las interacciones entre el analito polar y la fase estacionaria polar (en relación con la fase móvil), mayor será el tiempo de elución. La fuerza de la interacción depende de los grupos funcionales que forman parte de la estructura molecular del analito, con grupos más polarizados ( p. ej ., hidroxilo) y grupos capaces de formar enlaces de hidrógeno que inducen una mayor retención. Las interacciones culombicas (electrostáticas) también pueden aumentar la retención. El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuirá el tiempo de retención de los analitos, mientras que los disolventes más hidrófobos tienden a aumentar los tiempos de retención.
La cromatografía en fase normal fue uno de los primeros tipos de HPLC que desarrollaron los químicos, pero su uso ha disminuido en las últimas décadas. También conocido como HPLC de fase normal (NP-HPLC), este método separa analitos en función de su afinidad por una superficie estacionaria polar como la sílice; por lo tanto, se basa en la capacidad del analito para participar en interacciones polares (tales como enlaces de hidrógeno o interacciones de tipo dipolo-dipolo ) con la superficie del sorbente. NP-HPLC utiliza una fase móvil no polar y no acuosa ( p. ej ., cloroformo ) y funciona eficazmente para separar analitos fácilmente solubles en disolventes no polares. El analito se asocia y es retenido por la fase estacionaria polar. Las fuerzas de adsorción aumentan con el aumento de la polaridad del analito. La fuerza de interacción depende no sólo de los grupos funcionales presentes en la estructura de la molécula del analito, sino también de factores estéricos . El efecto del impedimento estérico sobre la fuerza de interacción permite que este método resuelva (separe) los isómeros estructurales .
El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuirá el tiempo de retención de los analitos, mientras que los disolventes más hidrófobos tienden a inducir una elución más lenta (mayores tiempos de retención). Los disolventes muy polares, como las trazas de agua en la fase móvil, tienden a adsorberse en la superficie sólida de la fase estacionaria formando una capa fija fija (agua) que se considera que desempeña un papel activo en la retención. Este comportamiento es algo peculiar de la cromatografía en fase normal porque se rige casi exclusivamente por un mecanismo de adsorción ( es decir , los analitos interactúan con una superficie sólida en lugar de con la capa solvatada de un ligando adherido a la superficie del sorbente; ver también HPLC de fase reversa a continuación). ). La cromatografía de adsorción todavía se utiliza en cierta medida para separaciones de isómeros estructurales en formatos de cromatografía de columna y de capa fina sobre soportes de sílice o alúmina activada (secada).
La HPLC de partición y la NP-HPLC cayeron en desgracia en la década de 1970 con el desarrollo de la HPLC de fase inversa debido a la escasa reproducibilidad de los tiempos de retención debido a la presencia de una capa de agua o de disolvente orgánico prótico en la superficie de los medios cromatográficos de sílice o alúmina . . Esta capa cambia con cualquier cambio en la composición de la fase móvil ( por ejemplo , nivel de humedad), lo que provoca cambios en los tiempos de retención.
Recientemente, la cromatografía de partición ha vuelto a ser popular con el desarrollo de fases unidas por enlaces hílicos que demuestran una reproducibilidad mejorada y debido a una mejor comprensión del rango de utilidad de la técnica.
El uso de la cromatografía de desplazamiento es bastante limitado y se utiliza principalmente para cromatografía preparativa. El principio básico se basa en una molécula con una alta afinidad por la matriz de cromatografía (el desplazador) que se utiliza para competir eficazmente por los sitios de unión y así desplazar a todas las moléculas con menores afinidades. [21] Existen claras diferencias entre la cromatografía de desplazamiento y de elución. En el modo de elución, las sustancias normalmente emergen de una columna en picos estrechos gaussianos. Se desea una amplia separación de los picos, preferiblemente hasta el valor inicial, para lograr la máxima purificación. La velocidad a la que cualquier componente de una mezcla desciende por la columna en modo de elución depende de muchos factores. Pero para que dos sustancias viajen a diferentes velocidades y, por tanto, se resuelvan, debe haber diferencias sustanciales en alguna interacción entre las biomoléculas y la matriz cromatográfica. Los parámetros operativos se ajustan para maximizar el efecto de esta diferencia. En muchos casos, la separación inicial de los picos sólo se puede lograr con elución en gradiente y cargas de columna bajas. Por lo tanto, dos inconvenientes de la cromatografía en modo de elución, especialmente a escala preparativa, son la complejidad operativa, debido al bombeo de disolvente en gradiente, y el bajo rendimiento, debido a las bajas cargas de la columna. La cromatografía de desplazamiento tiene ventajas sobre la cromatografía de elución en que los componentes se resuelven en zonas consecutivas de sustancias puras en lugar de "picos". Debido a que el proceso aprovecha la no linealidad de las isotermas, se puede separar una alimentación de columna más grande en una columna determinada con los componentes purificados recuperados en una concentración significativamente mayor.
La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) [22] es el modo de cromatografía más extendido. Tiene una fase estacionaria no polar y una fase móvil acuosa moderadamente polar. En los métodos de fase inversa, las sustancias se retienen en el sistema cuanto más hidrofóbicas sean. Para la retención de materiales orgánicos, las fases estacionarias, empaquetadas dentro de las columnas, están constituidas principalmente por gránulos porosos de gel de sílice de diversas formas, principalmente esféricas, de diferentes diámetros (1,5, 2, 3, 5, 7, 10 um), con diámetros de poro variables (60, 100, 150, 300, A), en cuya superficie se unen químicamente varios ligandos de hidrocarburos como C3, C4, C8, C18. También existen partículas poliméricas hidrofóbicas que sirven como fases estacionarias, cuando se necesitan soluciones a pH extremos, o sílice híbrida, polimerizada con sustancias orgánicas. Cuanto más tiempo permanezca el ligando hidrocarbonado en la fase estacionaria, más tiempo se podrán retener los componentes de la muestra. La mayoría de los métodos actuales de separación de materiales biomédicos utilizan columnas del tipo C-18, a veces denominadas con nombres comerciales como ODS (octadecilsilano) o RP-18 (fase inversa 18).
Las fases estacionarias de RP más comunes se basan en un soporte de sílice, cuya superficie se modifica uniendo RMe 2 SiCl, donde R es un grupo alquilo de cadena lineal como C 18 H 37 o C 8 H 17 .
Con tales fases estacionarias, el tiempo de retención es más largo para las moléculas lipófilas, mientras que las moléculas polares eluyen más fácilmente (emergen temprano en el análisis). Un cromatógrafo puede aumentar los tiempos de retención agregando más agua a la fase móvil, haciendo así que las interacciones del analito hidrofóbico con la fase estacionaria hidrofóbica sean relativamente más fuertes. De manera similar, un investigador puede disminuir el tiempo de retención agregando más solvente orgánico a la fase móvil. RP-HPLC se usa tan comúnmente entre los biólogos y usuarios de ciencias biológicas, por lo que a menudo se lo denomina incorrectamente simplemente "HPLC" sin más especificaciones. La industria farmacéutica también emplea regularmente RP-HPLC para calificar medicamentos antes de su lanzamiento.
RP-HPLC funciona según el principio de interacciones hidrofóbicas, que se origina en la alta simetría en la estructura dipolar del agua y desempeña el papel más importante en todos los procesos de las ciencias de la vida. RP-HPLC permite la medición de estas fuerzas interactivas. La unión del analito a la fase estacionaria es proporcional al área de la superficie de contacto alrededor del segmento no polar de la molécula del analito tras la asociación con el ligando en la fase estacionaria. Este efecto solvofóbico está dominado por la fuerza del agua para la "reducción de cavidades" alrededor del analito y la cadena C 18 frente al complejo de ambos. La energía liberada en este proceso es proporcional a la tensión superficial del eluyente (agua: 7,3 × 10 −6 J /cm 2 , metanol: 2,2 × 10 −6 J/cm 2 ) y a la superficie hidrófoba del analito y del ligando respectivamente. La retención se puede disminuir agregando un solvente menos polar (metanol, acetonitrilo ) a la fase móvil para reducir la tensión superficial del agua. La elución en gradiente utiliza este efecto reduciendo automáticamente la polaridad y la tensión superficial de la fase móvil acuosa durante el transcurso del análisis.
Las propiedades estructurales de la molécula del analito pueden desempeñar un papel importante en sus características de retención. En teoría, un analito con una mayor superficie hidrófoba (C – H, C – C y enlaces atómicos generalmente no polares, como SS y otros) puede retenerse por más tiempo ya que no interactúa con la estructura del agua. Por otro lado, los analitos con mayor superficie polar (como resultado de la presencia de grupos polares, como -OH, -NH 2 , COO − o -NH 3 + en su estructura) se retienen menos, ya que son mejores. integrado en el agua. Las interacciones con la fase estacionaria también pueden verse afectadas por efectos estéricos o efectos de exclusión, por los que un componente de una molécula muy grande puede tener sólo un acceso restringido a los poros de la fase estacionaria, donde tienen lugar las interacciones con los ligandos de superficie (cadenas alquílicas). Dicho obstáculo superficial normalmente da como resultado una menor retención.
El tiempo de retención aumenta con una superficie más hidrófoba (no polar) de las moléculas. Por ejemplo, los compuestos de cadena ramificada pueden eluir más rápidamente que sus correspondientes isómeros lineales porque su superficie total es menor. De manera similar, los compuestos orgánicos con enlaces simples C-C con frecuencia eluyen más tarde que aquellos con un enlace C=C o incluso triple, ya que el enlace doble o triple hace que la molécula sea más compacta que un enlace simple C-C.
Otro factor importante es el pH de la fase móvil ya que puede cambiar el carácter hidrofóbico del analito ionizable. Por esta razón, la mayoría de los métodos utilizan un agente tampón , como el fosfato de sodio , para controlar el pH. Los tampones sirven para múltiples propósitos: control del pH que afecta el estado de ionización de los analitos ionizables, afectan la carga sobre la superficie de sílice ionizable de la fase estacionaria entre los lindos de la fase unida y, en algunos casos, incluso actúan como agentes de emparejamiento iónico para neutralizar el analito. cargar. El formiato de amonio se agrega comúnmente en espectrometría de masas para mejorar la detección de ciertos analitos mediante la formación de aductos analito-amonio . A menudo se añade a la fase móvil un ácido orgánico volátil como el ácido acético , o más comúnmente el ácido fórmico , si se utiliza espectrometría de masas para analizar los efluentes de la columna.
El ácido trifluoroacético como aditivo para la fase móvil se usa ampliamente para mezclas complejas de muestras biomédicas, principalmente péptidos y proteínas, utilizando principalmente detectores basados en UV. Se utilizan raramente en métodos de espectrometría de masas, debido a los residuos que pueden dejar en el detector y el sistema de administración de disolvente, que interfieren con el análisis y la detección. Sin embargo, puede ser muy eficaz para mejorar la retención de analitos como los ácidos carboxílicos , en aplicaciones que utilizan otros detectores como UV-VIS, ya que es un ácido orgánico bastante fuerte. Los efectos de los ácidos y tampones varían según la aplicación, pero generalmente mejoran la resolución cromatográfica cuando se trata de componentes ionizables.
Las columnas de fase reversa son bastante difíciles de dañar en comparación con las columnas de sílice normales, gracias al efecto protector de los ligandos hidrófobos unidos; sin embargo, la mayoría de las columnas de fase reversa consisten en partículas de sílice derivatizadas con alquilo y son propensas a la hidrólisis de la sílice en condiciones extremas de pH en la fase móvil. La mayoría de los tipos de columnas RP no deben usarse con bases acuosas , ya que hidrolizarán la partícula de sílice subyacente y la disolverán. Existen marcas seleccionadas de partículas de columnas RP híbridas o basadas en sílice forzada que se pueden utilizar en condiciones de pH extremas. Tampoco se recomienda el uso de condiciones ácidas extremas, ya que también podrían hidrolizar y corroer las paredes interiores de las partes metálicas del equipo de HPLC.
Como regla general, en la mayoría de los casos las columnas RP-HPLC deben lavarse con solvente limpio después de su uso para eliminar los ácidos o tampones residuales y almacenarse en una composición adecuada de solvente. Algunas aplicaciones biomédicas requieren un entorno no metálico para una separación óptima. Para casos tan sensibles, existe una prueba para determinar el contenido de metal de una columna que consiste en inyectar una muestra que es una mezcla de 2,2'- y 4,4'- bipiridina . Debido a que el 2,2'-bipy puede quelar el metal, la forma del pico del 2,2'-bipy se distorsionará (cola) cuando haya iones metálicos presentes en la superficie de la sílice . [ cita requerida ] ..
La cromatografía de exclusión por tamaño ( SEC ) [23] separa moléculas de polímeros y biomoléculas en función de diferencias en su tamaño molecular (en realidad, por el radio de Stokes de una partícula ). El proceso de separación se basa en la capacidad de las moléculas de la muestra para permear a través de los poros de las esferas de gel, empaquetadas dentro de la columna, y depende del tamaño relativo de las moléculas del analito y del respectivo tamaño de poro del absorbente. El proceso también se basa en la ausencia de interacciones con la superficie del material de embalaje.
Generalmente se denominan dos tipos de SEC:
El principio de separación en SEC se basa en la penetración total o parcial de las sustancias de alto peso molecular de la muestra en las partículas porosas de la fase estacionaria durante su transporte a través de la columna. El eluyente de la fase móvil se selecciona de tal manera que impida totalmente las interacciones con la superficie de la fase estacionaria. En estas condiciones, cuanto menor es el tamaño de la molécula, más capaz es de penetrar dentro del espacio poroso y el movimiento a través de la columna tarda más. Por otro lado, cuanto mayor sea el tamaño molecular, mayor será la probabilidad de que la molécula no penetre completamente en los poros de la fase estacionaria, e incluso viaje alrededor de ellos, por lo que será eluida antes. Las moléculas se separan en orden de peso molecular decreciente: las moléculas más grandes eluyen primero de la columna y las moléculas más pequeñas eluyen después. Las moléculas más grandes que el tamaño de los poros no ingresan a los poros en absoluto y eluyen juntas como el primer pico en el cromatograma; esto se denomina volumen de exclusión total, que define el límite de exclusión para una columna en particular. Las moléculas pequeñas penetrarán completamente a través de los poros de las partículas de la fase estacionaria y serán eluidas en último lugar, marcando el final del cromatograma, y pueden aparecer como un marcador de penetración total.
En las ciencias biomédicas generalmente se considera una cromatografía de baja resolución y, por lo tanto, a menudo se reserva para el paso final de "pulido" de la purificación. También es útil para determinar la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de proteínas purificadas. La SEC se utiliza principalmente para el análisis de moléculas grandes, como proteínas o polímeros. La SEC también funciona de forma preparativa atrapando las moléculas más pequeñas en los poros de las partículas. Las moléculas más grandes simplemente pasan por los poros porque son demasiado grandes para entrar en ellos. Por lo tanto, las moléculas más grandes fluyen a través de la columna más rápido que las moléculas más pequeñas: es decir, cuanto más pequeña es la molécula, mayor es el tiempo de retención.
Esta técnica se utiliza ampliamente para la determinación del peso molecular de polisacáridos. La SEC es la técnica oficial (sugerida por la farmacopea europea) para la comparación del peso molecular de diferentes heparinas de bajo peso molecular disponibles comercialmente . [24]
La cromatografía de intercambio iónico ( IEC ) o cromatografía iónica ( IC ) [25] es una técnica analítica para la separación y determinación de solutos iónicos en muestras acuosas de origen ambiental e industrial como la industria metalúrgica, aguas residuales industriales, en sistemas biológicos, farmacéuticos. muestras, alimentos, etc. La retención se basa en la atracción entre los iones del soluto y los sitios cargados unidos a la fase estacionaria. Los iones de soluto cargados de la misma manera que los iones de la columna son rechazados y eluidos sin retención, mientras que los iones de soluto cargados de manera opuesta a los sitios cargados de la columna se retienen en ella. Los iones solutos retenidos en la columna se pueden eluir cambiando la composición de la fase móvil, como aumentando su concentración de sal y pH o aumentando la temperatura de la columna, etc.
Los tipos de intercambiadores de iones incluyen resinas de poliestireno , intercambiadores de iones (geles) de celulosa y dextrano y vidrio de poro controlado o gel de sílice poroso . Las resinas de poliestireno permiten la reticulación, lo que aumenta la estabilidad de la cadena. Una mayor vinculación cruzada reduce los desvíos, lo que aumenta el tiempo de equilibrio y, en última instancia, mejora la selectividad. Los intercambiadores de iones de celulosa y dextrano poseen tamaños de poro más grandes y densidades de carga bajas, lo que los hace adecuados para la separación de proteínas.
En general, los intercambiadores de iones favorecen la unión de iones de mayor carga y menor radio.
Un aumento en la concentración de contraiones (con respecto a los grupos funcionales de las resinas) reduce el tiempo de retención, ya que crea una fuerte competencia con los iones solutos. Una disminución del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, mientras que un aumento del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio aniónico. Al reducir el pH del disolvente en una columna de intercambio catiónico, por ejemplo, hay más iones de hidrógeno disponibles para competir por posiciones en la fase estacionaria aniónica, eluyendo así cationes débilmente unidos.
Esta forma de cromatografía se usa ampliamente en las siguientes aplicaciones: purificación de agua, preconcentración de componentes traza, cromatografía de intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio iónico de proteínas, cromatografía de intercambio aniónico de alto pH de carbohidratos y oligosacáridos, y otras.
La cromatografía de afinidad de alto rendimiento (HPAC) [26] funciona haciendo pasar una solución de muestra a través de una columna llena de una fase estacionaria que contiene un ligando biológicamente activo inmovilizado. De hecho, el ligando es un sustrato que tiene una afinidad de unión específica por la molécula diana en la solución de muestra. La molécula objetivo se une al ligando, mientras que las otras moléculas de la solución de muestra pasan a través de la columna y tienen poca o ninguna retención. A continuación, la molécula diana se eluye de la columna utilizando un tampón de elución adecuado.
Este proceso cromatográfico se basa en la capacidad de las sustancias activas unidas de formar complejos estables, específicos y reversibles gracias a su reconocimiento biológico de ciertos componentes específicos de la muestra. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares comunes como la interacción de Van der Waals , la interacción electrostática, la interacción dipolo-dipolo, la interacción hidrofóbica y el enlace de hidrógeno. Un enlace bioespecífico eficiente se forma mediante la acción simultánea y concertada de varias de estas fuerzas en los sitios de unión complementarios.
La cromatografía acuosa de fase normal ( ANP ) también se denomina cromatografía líquida de interacción hidrófila ( HILIC ). [27] Esta es una técnica cromatográfica que abarca la región de fase móvil entre la cromatografía de fase reversa (RP) y la cromatografía orgánica de fase normal (ONP). HILIC se utiliza para lograr una selectividad única para compuestos hidrófilos, [28] que muestra un orden de elución de fase normal, utilizando "disolventes de fase inversa", es decir, disolventes relativamente polares en su mayoría no acuosos en la fase móvil. [27] Muchas moléculas biológicas, especialmente las que se encuentran en fluidos biológicos, son pequeños compuestos polares que no se retienen bien mediante HPLC de fase reversa. Esto ha hecho que la interacción hidrófila LC (HILIC) sea una alternativa atractiva y un enfoque útil para el análisis de moléculas polares. Además, debido a que HILIC se usa habitualmente con mezclas acuosas tradicionales con solventes orgánicos polares como ACN y metanol, se puede acoplar fácilmente a MS. [29]
Una separación en la que la composición de la fase móvil permanece constante durante todo el procedimiento se denomina isocrática (que significa composición constante ). La palabra fue acuñada por Csaba Horvath , uno de los pioneros del HPLC. [30] [31]
La composición de la fase móvil no tiene por qué permanecer constante. Una separación en la que la composición de la fase móvil cambia durante el proceso de separación se describe como elución en gradiente . [32] [33] Por ejemplo, un gradiente puede comenzar con 10% de metanol en agua y terminar con 90% de metanol en agua después de 20 minutos. Los dos componentes de la fase móvil normalmente se denominan "A" y "B"; A es el disolvente "débil" que permite que el soluto eluya sólo lentamente, mientras que B es el disolvente "fuerte" que eluye rápidamente los solutos de la columna. En la cromatografía de fase inversa , el disolvente A suele ser agua o un tampón acuoso, mientras que B es un disolvente orgánico miscible con agua, como acetonitrilo , metanol, THF o isopropanol .
En la elución isocrática, el ancho del pico aumenta linealmente con el tiempo de retención según la ecuación para N, el número de placas teóricas. Esto puede ser una desventaja importante al analizar una muestra que contiene analitos con una amplia gama de factores de retención. Al utilizar una fase móvil más débil, el tiempo de ejecución se alarga y da como resultado picos de elución lenta que son amplios, lo que lleva a una sensibilidad reducida. Una fase móvil más fuerte mejoraría los problemas de tiempo de ejecución y la ampliación de los picos posteriores, pero da como resultado una separación de picos disminuida, especialmente para analitos que eluyen rápidamente y que pueden no tener tiempo suficiente para resolverse por completo. Este problema se aborda mediante la composición cambiante de la fase móvil de la elución en gradiente.
Al comenzar desde una fase móvil más débil y fortalecerla durante el tiempo de ejecución, la elución en gradiente disminuye la retención de los componentes que eluyen más tarde para que eluyan más rápido, dando picos más estrechos (y más altos) para la mayoría de los componentes, al mismo tiempo que permite la separación adecuada de componentes de elución temprana. Esto también mejora la forma de los picos con cola, ya que la concentración creciente del eluyente orgánico empuja la parte de cola de un pico hacia adelante. Esto también aumenta la altura del pico (el pico parece "más nítido"), lo cual es importante en el análisis de trazas. El programa de gradiente puede incluir aumentos repentinos en "escalones" en el porcentaje del componente orgánico, o diferentes pendientes en diferentes momentos, todo de acuerdo con el deseo de una separación óptima en un tiempo mínimo.
En la elución isocrática, el orden de retención no cambia si cambian las dimensiones de la columna (longitud y diámetro interior), es decir, los picos eluyen en el mismo orden. Sin embargo, en la elución en gradiente, el orden de elución puede cambiar a medida que cambian las dimensiones o el caudal. si no se reducen o aumentan según el cambio [34]
La fuerza impulsora de la cromatografía de fase reversa se origina en el orden superior de la estructura del agua. El papel del componente orgánico de la fase móvil es reducir este alto orden y así reducir la fuerza retardante del componente acuoso.
La teoría de la cromatografía líquida de alta resolución-HPLC es básicamente la misma que la teoría de la cromatografía general. [35] quien recibió el premio Nobel por ello. La teoría de la cromatografía se ha utilizado como base para las pruebas de idoneidad del sistema , como se puede ver en la Farmacopaeia de la USP, [36] que son un conjunto de criterios cuantitativos que prueban la idoneidad del sistema HPLC para el análisis requerido en cualquier momento. paso de ello.
Esta relación también se representa como un factor normalizado sin unidades conocido como factor de retención , o parámetro de retención, que es la medida experimental del índice de capacidad, como se muestra también en la Figura de criterios de rendimiento. t R es el tiempo de retención del componente específico y t 0 es el tiempo que tarda una sustancia no retenida en eluir a través del sistema sin ninguna retención, por lo que se denomina tiempo vacío.
La relación entre los factores de retención, k', de cada dos picos adyacentes en el cromatograma se utiliza en la evaluación del grado de separación entre ellos, y se denomina factor de selectividad , α, como se muestra en el gráfico de Criterios de rendimiento.
El recuento de placas N como criterio para la eficiencia del sistema se desarrolló para condiciones isocráticas, es decir, una composición de fase móvil constante durante todo el proceso. En condiciones de gradiente, donde la fase móvil cambia con el tiempo durante la ejecución cromatográfica, es más apropiado utilizar el parámetro de capacidad máxima P c como medida de la eficiencia del sistema. [37] La definición de capacidad de pico en cromatografía es el número de picos que se pueden separar dentro de una ventana de retención para un factor de resolución predefinido específico, generalmente ~1. También podría concebirse como el tiempo de ejecución medido en número de anchos promedio de picos. La ecuación se muestra en la Figura de los criterios de desempeño. En esta ecuación, tg es el tiempo de gradiente y w(ave) es el ancho promedio de los picos en la base.
Los parámetros se derivan en gran medida de dos conjuntos de teoría cromatográfica: la teoría de placas (como parte de la cromatografía de partición ) y la teoría de velocidad de la cromatografía/ ecuación de Van Deemter . Por supuesto, se pueden poner en práctica mediante el análisis de cromatogramas de HPLC, aunque la teoría de la velocidad se considera la teoría más precisa.
Son análogos al cálculo del factor de retención para una separación por cromatografía en papel , pero describen qué tan bien la HPLC separa una mezcla en dos o más componentes que se detectan como picos (bandas) en un cromatograma. Los parámetros de HPLC son: factor de eficiencia ( N ), factor de retención (kappa prime) y factor de separación (alfa). Juntos, los factores son variables en una ecuación de resolución, que describe qué tan bien se separaron o superpusieron los picos de dos componentes. Estos parámetros se utilizan principalmente sólo para describir las separaciones de fase reversa de HPLC y de fase normal de HPLC, ya que esas separaciones tienden a ser más sutiles que otros modos de HPLC ( p. ej ., intercambio iónico y exclusión de tamaño).
El volumen vacío es la cantidad de espacio en una columna que está ocupado por el solvente. Es el espacio dentro de la columna que está fuera del material de embalaje interno de la columna. El volumen vacío se mide en un cromatograma como el primer pico del componente detectado, que suele ser el disolvente que estaba presente en la mezcla de muestra; Idealmente, el disolvente de la muestra fluye a través de la columna sin interactuar con la columna, pero aún es detectable a diferencia del disolvente de HPLC. El volumen vacío se utiliza como factor de corrección.
El factor de eficiencia ( N ) prácticamente mide qué tan nítidos son los picos de los componentes en el cromatograma, como relación entre el área del pico del componente ("tiempo de retención") en relación con el ancho de los picos en su punto más ancho (en la línea de base). Los picos altos, agudos y relativamente estrechos indican que el método de separación eliminó eficientemente un componente de una mezcla; alta eficiencia. La eficiencia depende en gran medida de la columna de HPLC y del método de HPLC utilizado. El factor de eficiencia es sinónimo de número de platos y del 'número de platos teóricos'.
El factor de retención ( kappa prime ) mide cuánto tiempo un componente de la mezcla se adhirió a la columna, medido por el área bajo la curva de su pico en un cromatograma (ya que los cromatogramas de HPLC son función del tiempo). Cada pico del cromatograma tendrá su propio factor de retención ( p. ej ., kappa 1 para el factor de retención del primer pico). Este factor puede corregirse por el volumen vacío de la columna.
El factor de separación ( alfa ) es una comparación relativa de qué tan bien se separaron dos componentes vecinos de la mezcla ( es decir , dos bandas vecinas en un cromatograma). Este factor se define en términos de una relación de los factores de retención de un par de picos de cromatograma vecinos y también puede corregirse por el volumen vacío de la columna. Cuanto mayor sea el valor del factor de separación por encima de 1,0, mejor será la separación, hasta aproximadamente 2,0 más allá del cual probablemente no sea necesario un método de HPLC para la separación. Las ecuaciones de resolución relacionan los tres factores de manera que la alta eficiencia y los factores de separación mejoran la resolución de los picos de los componentes en una separación por HPLC.
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El diámetro interno (ID) de una columna de HPLC es un parámetro importante. [38] Puede influir en la respuesta de detección cuando se reduce debido a la difusión lateral reducida de la banda de soluto. También puede afectar la selectividad de la separación, cuando el caudal y los volúmenes de inyección no se reducen o aumentan proporcionalmente al diámetro mayor o menor utilizado, tanto en el modo isocrático como en el modo gradiente. [39] Determina la cantidad de analito que se puede cargar en la columna. Las columnas de mayor diámetro suelen verse en aplicaciones preparativas, como la purificación de un producto farmacéutico para su uso posterior. [40] Las columnas de ID baja tienen una sensibilidad mejorada y un menor consumo de disolventes en la reciente cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC). [41]
Se utilizan columnas de DI más grandes (más de 10 mm) para purificar cantidades utilizables de material debido a su gran capacidad de carga.
Las columnas de escala analítica (4,6 mm) han sido el tipo más común de columnas, aunque las columnas más estrechas [41] están ganando rápidamente popularidad. Se utilizan en el análisis cuantitativo tradicional de muestras y, a menudo, utilizan un detector de absorbancia UV-Vis .
Las columnas de calibre estrecho (1–2 mm) se utilizan para aplicaciones en las que se desea una mayor sensibilidad, ya sea con detectores UV-vis especiales, detección de fluorescencia o con otros métodos de detección como cromatografía líquida-espectrometría de masas.
Las columnas capilares (de menos de 0,3 mm) se utilizan casi exclusivamente con medios de detección alternativos como la espectrometría de masas . Por lo general, están hechos de capilares de sílice fundida , en lugar de los tubos de acero inoxidable que emplean las columnas más grandes.
La mayoría de las HPLC tradicionales se realizan con la fase estacionaria unida al exterior de pequeñas partículas esféricas de sílice (perlas muy pequeñas). Estas partículas vienen en una variedad de tamaños, siendo las más comunes las perlas de 5 µm. Las partículas más pequeñas generalmente proporcionan más área superficial y mejores separaciones, pero la presión requerida para una velocidad lineal óptima aumenta en la inversa del diámetro de la partícula al cuadrado. [42] [43] [44]
De acuerdo con las ecuaciones [45] de velocidad, eficiencia y contrapresión de la columna , reducir el diámetro de las partículas a la mitad y mantener el mismo tamaño de la columna duplicará la velocidad y la eficiencia de la columna; pero aumenta cuatro veces la contrapresión. Y la HPLC de partículas pequeñas también puede disminuir el ensanchamiento del ancho. [46] Las partículas más grandes se utilizan en HPLC preparativa (diámetros de columna de 5 cm a >30 cm) y para aplicaciones que no son de HPLC, como la extracción en fase sólida .
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor superficie, mientras que los poros de mayor tamaño tienen una mejor cinética, especialmente para analitos más grandes. Por ejemplo, una proteína que es sólo un poco más pequeña que un poro podría entrar en el poro pero no salir fácilmente una vez dentro.
Las bombas varían en capacidad de presión, pero su rendimiento se mide en función de su capacidad para producir un caudal volumétrico constante y reproducible . La presión puede alcanzar hasta 60 MPa (6000 lbf/in2 ) , o alrededor de 600 atmósferas. Los sistemas HPLC modernos se han mejorado para trabajar a presiones mucho más altas y, por lo tanto, pueden utilizar tamaños de partículas mucho más pequeños en las columnas (<2 μm). Estos sistemas de "cromatografía líquida de rendimiento ultra alto" o UHPLC, que también podrían conocerse como sistemas de cromatografía de presión ultra alta, [47] pueden funcionar a hasta 120 MPa (17 405 lbf/in 2 ), o alrededor de 1200 atmósferas. [48] El término "UPLC" [49] es una marca registrada de Waters Corporation , pero a veces se utiliza para referirse a la técnica más general de UHPLC.
Los detectores de HPLC se dividen en dos categorías principales: universales o selectivos. Los detectores universales normalmente miden una propiedad global ( p . ej ., índice de refracción ) midiendo una diferencia de una propiedad física entre la fase móvil y la fase móvil con soluto, mientras que los detectores selectivos miden una propiedad del soluto ( p. ej ., absorbancia UV-Vis ) simplemente respondiendo a la Propiedad física o química del soluto. [50] La HPLC utiliza más comúnmente un detector de absorbancia UV-Vis ; sin embargo, se puede utilizar una amplia gama de otros detectores de cromatografía . Un detector universal que complementa la detección de absorbancia UV-Vis es el detector de aerosol cargado (CAD). Un tipo de detector comúnmente utilizado incluye detectores de índice de refracción, que proporcionan lecturas midiendo los cambios en el índice de refracción del eluyente a medida que se mueve a través de la celda de flujo. En determinados casos, es posible utilizar varios detectores; por ejemplo, el LCMS normalmente combina UV-Vis con un espectrómetro de masas.
Cuando se utiliza con un detector electroquímico (ECD), el HPLC-ECD detecta selectivamente neurotransmisores como: norepinefrina , dopamina , serotonina , glutamato , GABA, acetilcolina y otros en aplicaciones de investigación de análisis neuroquímicos. [51] El HPLC-ECD detecta neurotransmisores en el rango femtomolar . Otros métodos para detectar neurotransmisores incluyen cromatografía líquida-espectrometría de masas, ELISA o radioinmunoensayos.
Se pueden inyectar automáticamente grandes cantidades de muestras en un sistema HPLC mediante el uso de muestreadores automáticos de HPLC. Además, los muestreadores automáticos de HPLC tienen un volumen y una técnica de inyección exactamente iguales para cada inyección, por lo que proporcionan un alto grado de precisión del volumen de inyección. Es posible permitir la agitación de la muestra dentro de la cámara de muestreo, promoviendo así la homogeneidad. [52]
La HPLC tiene muchas aplicaciones tanto en laboratorio como en ciencias clínicas. Es una técnica común utilizada en el desarrollo farmacéutico, ya que es una forma confiable de obtener y garantizar la pureza del producto. [53] Si bien la HPLC puede producir productos (puros) de muy alta calidad, no siempre es el método principal utilizado en la producción de materiales farmacológicos a granel. [54] Según la farmacopea europea, la HPLC se utiliza sólo en el 15,5% de las síntesis. [55] Sin embargo, desempeña un papel en el 44% de las síntesis en la farmacopea de los Estados Unidos. [56] Esto podría deberse posiblemente a diferencias en las limitaciones monetarias y de tiempo, ya que la HPLC a gran escala puede ser una técnica costosa. Lamentablemente, el aumento de la especificidad, la precisión y la exactitud que se produce con la HPLC corresponde a un aumento del coste.
Esta técnica también se utiliza para la detección de drogas ilícitas en diversas muestras. [57] El método más común de detección de drogas ha sido un inmunoensayo . [58] Este método es mucho más conveniente. Sin embargo, la conveniencia tiene el costo de la especificidad y la cobertura de una amplia gama de medicamentos, por lo que se ha utilizado la HPLC como método alternativo. Como la HPLC es un método para determinar (y posiblemente aumentar) la pureza, utilizar la HPLC sola para evaluar las concentraciones de fármacos fue algo insuficiente. Por lo tanto, la HPLC en este contexto a menudo se realiza junto con la espectrometría de masas . [59] El uso de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) en lugar de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) evita la necesidad de derivatizar con agentes acetilantes o alquilantes, lo que puede ser un paso adicional engorroso. [60] La LC-MS se ha utilizado para detectar una variedad de agentes como agentes dopantes, metabolitos de drogas, conjugados de glucurónido, anfetaminas, opioides, cocaína, BZD, ketamina, LSD, cannabis y pesticidas. [61] [62] La realización de HPLC junto con la espectrometría de masas reduce la necesidad absoluta de estandarizar las ejecuciones experimentales de HPLC.
Se pueden realizar ensayos similares con fines de investigación, detectando concentraciones de posibles candidatos clínicos, como medicamentos antimicóticos y para el asma. [63] Esta técnica también es obviamente útil para observar múltiples especies en muestras recolectadas, pero requiere el uso de soluciones estándar cuando se busca información sobre la identidad de las especies. Se utiliza como método para confirmar resultados de reacciones de síntesis, ya que la pureza es fundamental en este tipo de investigación. Sin embargo, la espectrometría de masas sigue siendo la forma más fiable de identificar especies.
El uso médico de HPLC suele utilizar un espectrómetro de masas (MS) como detector, por lo que la técnica se denomina LC-MS [64] o LC-MS/MS para MS en tándem, donde se operan dos tipos de MS secuencialmente. [65] Cuando el instrumento HPLC está conectado a más de un detector, se denomina sistema LC con guión. [ cita necesaria ] Las aplicaciones farmacéuticas [66] son los principales usuarios de HPLC, LC-MS y LC-MS/MS. [67] Esto incluye el desarrollo de fármacos [68] y la farmacología, que es el estudio científico de los efectos de los fármacos y sustancias químicas en los organismos vivos, [69] la medicina personalizada, [70] la salud pública [71] [72] y el diagnóstico. [73] Si bien la orina es el medio más común para analizar las concentraciones de fármacos, el suero sanguíneo es la muestra recolectada para la mayoría de los análisis médicos con HPLC. [74] Una de las funciones más importantes de LC-MS y LC-MS/MS en el laboratorio clínico es la detección de trastornos metabólicos en recién nacidos (NBS) [75] y el diagnóstico de seguimiento. [76] [77] Las muestras de los bebés vienen en forma de gota de sangre seca (DBS), [78] que es fácil de preparar y transportar, lo que permite diagnósticos seguros y accesibles, tanto a nivel local como global.
Se han probado otros métodos de detección de moléculas que son útiles para estudios clínicos frente a HPLC, concretamente los inmunoensayos. En un ejemplo de esto, se compararon los ensayos competitivos de unión a proteínas (CPBA) y la HPLC para determinar la sensibilidad en la detección de vitamina D. Útil para diagnosticar deficiencias de vitamina D en niños, se encontró que la sensibilidad y especificidad de este CPBA alcanzaban solo el 40 % y el 60 %. %, respectivamente, de la capacidad de HPLC. [79] Si bien es una herramienta costosa, la precisión de la HPLC es casi incomparable.
