La cromatografía de interacción hidrofílica (o cromatografía líquida de interacción hidrofílica , HILIC ) [1] es una variante de la cromatografía líquida de fase normal que se superpone parcialmente con otras aplicaciones cromatográficas como la cromatografía iónica y la cromatografía líquida de fase reversa . La HILIC utiliza fases estacionarias hidrofílicas con eluyentes de tipo fase reversa . El nombre fue sugerido por Andrew Alpert en su artículo de 1990 sobre el tema. [2] Describió el mecanismo cromatográfico para ello como cromatografía de partición líquido-líquido donde los analitos eluyen en orden de polaridad creciente, una conclusión respaldada por una revisión y reevaluación de los datos publicados. [3]
Cualquier superficie cromatográfica polar puede utilizarse para las separaciones HILIC. Incluso se han utilizado sílices enlazadas no polares con una composición de disolvente orgánico extremadamente alta, gracias a las zonas expuestas de sílice entre los ligandos enlazados en el soporte, lo que puede afectar las interacciones. [4] Con esa excepción, las fases HILIC pueden agruparse en cinco categorías de superficies polares o iónicas neutras: [5]
Una fase móvil típica para la cromatografía HILIC incluye acetonitrilo ("MeCN", también denominado "ACN") con una pequeña cantidad de agua. Sin embargo, se puede utilizar cualquier disolvente aprótico miscible con agua (por ejemplo, THF o dioxano ). También se pueden utilizar alcoholes, sin embargo, su concentración debe ser mayor para lograr el mismo grado de retención para un analito en relación con una combinación de disolvente aprótico y agua. Véase también Cromatografía en fase normal acuosa .
Se cree comúnmente que en HILIC, la fase móvil forma una capa rica en agua en la superficie de la fase estacionaria polar frente a la fase móvil deficiente en agua , creando un sistema de extracción líquido/líquido. El analito se distribuye entre estas dos capas. Sin embargo, HILIC es más que una simple partición e incluye interacciones de donantes de hidrógeno entre especies polares neutras, así como mecanismos electrostáticos débiles en las condiciones de alto contenido de disolventes orgánicos utilizadas para la retención. Esto distingue a HILIC como un mecanismo distinto de la cromatografía de intercambio iónico . Los compuestos más polares tendrán una interacción más fuerte con la capa acuosa estacionaria que los compuestos menos polares. Por lo tanto, se produce una separación basada en la polaridad y el grado de solvatación de un compuesto.
Los aditivos iónicos , como el acetato de amonio y el formato de amonio, se utilizan habitualmente para controlar el pH de la fase móvil y la fuerza iónica. En HILIC también pueden contribuir a la polaridad del analito, lo que da como resultado cambios diferenciales en la retención. Para analitos extremadamente polares (por ejemplo, antibióticos aminoglucósidos ( gentamicina ) o trifosfato de adenosina ), se requieren concentraciones más altas de tampón (c. 100 mM) para garantizar que el analito esté en una sola forma iónica. De lo contrario, se observará una forma de pico asimétrica, cola cromatográfica y/o una recuperación deficiente de la fase estacionaria. Para la separación de analitos polares neutros (por ejemplo, carbohidratos), no es necesario ningún tampón.
Se pueden utilizar otras sales, como el perclorato de sodio 100–300 mM, que son solubles en mezclas de solventes con alto contenido orgánico (aproximadamente 70–90 % de acetonitrilo ), para aumentar la polaridad de la fase móvil y afectar la elución. Estas sales no son volátiles, por lo que esta técnica es menos útil con un espectrómetro de masas como detector. Por lo general, un gradiente (a cantidades crecientes de agua) es suficiente para promover la elución.
Todos los iones se dividen en la fase estacionaria hasta cierto punto, por lo que se requiere un "lavado" ocasional con agua para garantizar una fase estacionaria reproducible.
El modo de separación HILIC se utiliza ampliamente para la separación de algunas biomoléculas , moléculas orgánicas y algunas inorgánicas [11] por diferencias en la polaridad. Su utilidad ha aumentado debido a la preparación simplificada de muestras para muestras biológicas, al analizar metabolitos, ya que el proceso metabólico generalmente resulta en la adición de grupos polares para mejorar la eliminación del tejido celular. Esta técnica de separación también es particularmente adecuada para el análisis de glicosilación [12] y el control de calidad de glicoproteínas y glicoformas en productos médicos biológicos . [13] Para la detección de compuestos polares con el uso de espectrometría de masas de ionización por electrospray como detector cromatográfico, HILIC puede ofrecer un aumento de diez veces en la sensibilidad sobre la cromatografía de fase inversa [11] porque el solvente orgánico es mucho más volátil.
En el caso de las superficies químicas débilmente iónicas, la elección del pH puede afectar a la naturaleza iónica de la química de la columna. Si se ajusta correctamente, el pH se puede configurar para reducir la selectividad hacia los grupos funcionales con la misma carga que la columna, o para mejorarla para los grupos funcionales con carga opuesta. De manera similar, la elección del pH afecta a la polaridad de los solutos. Sin embargo, en el caso de las superficies químicas de las columnas que son fuertemente iónicas y, por lo tanto, resistentes a los valores de pH en el rango medio de la escala de pH (pH 3,5–8,5), estas separaciones reflejarán únicamente la polaridad de los analitos y, por lo tanto, podrían ser más fáciles de entender al desarrollar métodos.
En 2008, Alpert acuñó el término ERLIC [14] (cromatografía de interacción hidrofílica por repulsión electrostática), para las separaciones HILIC en las que se utiliza una química de superficie de columna iónica para repeler un grupo polar iónico común en un analito o dentro de un conjunto de analitos, para facilitar la separación por los grupos polares restantes. Los efectos electrostáticos tienen un potencial químico de un orden de magnitud más fuerte que los efectos polares neutros. Esto permite minimizar la influencia de un grupo iónico común dentro de un conjunto de moléculas de analito; o reducir el grado de retención de estos grupos funcionales más polares, incluso permitiendo separaciones isocráticas en lugar de un gradiente en algunas situaciones. Su publicación posterior describió con más detalle los efectos de orientación [15] que otros también han llamado fase normal de par iónico [16] o e-HILIC, que reflejan mecanismos de retención sensibles a una porción iónica particular del analito, ya sea atractiva o repulsiva. Las separaciones ERLIC (eHILIC) no necesitan ser isocráticas, pero el efecto neto es la reducción de la atracción de un grupo polar particularmente fuerte, que luego requiere condiciones de elución menos fuertes, y la interacción mejorada de los grupos funcionales polares restantes (iónicos o no iónicos de carga opuesta) del analito(s). Basándose en la columna ERLIC inventada por Andrew Alpert, se desarrolló una nueva metodología de mapeo de péptidos con propiedades únicas de separación de la desamidación e isomerización de la asparagina. Estas propiedades únicas serían muy beneficiosas para el futuro monitoreo de atributos múltiples basado en espectrometría de masas en el control de calidad de productos biológicos. [17]
Por ejemplo, se podría utilizar una química de superficie de intercambio catiónico (cargada negativamente) para las separaciones ERLIC para reducir la influencia en la retención de grupos aniónicos (cargados negativamente) (los fosfatos de nucleótidos o de mezclas de antibióticos de fosfonilo; o grupos de ácido siálico de carbohidratos modificados) para permitir ahora la separación basada más en los grupos funcionales básicos y/o neutros de estas moléculas. Modificar la polaridad de un grupo débilmente iónico (por ejemplo, carboxilo) en la superficie se logra fácilmente ajustando el pH para que esté dentro de dos unidades de pH del pKa de ese grupo. Para los grupos funcionales fuertemente iónicos de la superficie (es decir, sulfatos o fosfatos), se podría utilizar en cambio una cantidad menor de tampón para que la carga residual no esté completamente emparejada por iones. Un ejemplo de esto sería el uso de una fase móvil de 12,5 mM (en lugar del tampón recomendado >20 mM), pH 9,2 sobre una superficie polimérica , zwitteriónica , de betaína - sulfonato para separar mezclas de antibióticos fosfonílicos (cada una de las cuales contiene un grupo fosfato). Esto mejora la influencia de los grupos funcionales de ácido sulfónico de la química de la superficie de la columna sobre su amina cuaternaria, ligeramente disminuida (por el pH). En consonancia con esto, estos analitos mostrarán una retención reducida en la columna eluyendo antes y en mayores cantidades de disolvente orgánico que si se utilizara una superficie HILIC polar neutra. Esto también aumenta su sensibilidad de detección mediante espectrometría de masas de iones negativos.
Por analogía con lo anterior, se puede utilizar una química de superficie de columna de intercambio aniónico (cargada positivamente) para reducir la influencia en la retención de grupos funcionales catiónicos (cargados positivamente) para un conjunto de analitos, como cuando se aíslan selectivamente péptidos fosforilados o moléculas de polisacáridos sulfatados. El uso de un pH entre 1 y 2 unidades de pH reducirá la polaridad de dos de los tres oxígenos ionizables del grupo fosfato y, por lo tanto, permitirá una fácil desorción de la química de superficie (cargada opuesta). También reducirá la influencia de los carboxilos cargados negativamente en los analitos, ya que estarán protonados a este valor de pH bajo y, por lo tanto, contribuirán con menos polaridad general a la molécula. Cualquier grupo amino común con carga positiva será repelido de la química de superficie de la columna y, por lo tanto, estas condiciones mejoran el papel de la polaridad del fosfato (así como otros grupos polares neutros) en la separación.