La cromatografía líquida-espectrometría de masas ( LC-MS ) es una técnica de química analítica que combina las capacidades de separación física de la cromatografía líquida (o HPLC ) con las capacidades de análisis de masas de la espectrometría de masas (MS). Cromatografía acoplada: los sistemas MS son populares en el análisis químico porque las capacidades individuales de cada técnica se mejoran de forma sinérgica. Mientras que la cromatografía líquida separa mezclas con múltiples componentes, la espectrometría de masas proporciona información espectral que puede ayudar a identificar (o confirmar la identidad sospechosa de) cada componente separado. [1] La MS no solo es sensible, sino que proporciona detección selectiva, aliviando la necesidad de una separación cromatográfica completa. [2] La LC-MS también es apropiada para la metabolómica debido a su buena cobertura de una amplia gama de sustancias químicas. [3] Esta técnica en tándem se puede utilizar para analizar compuestos bioquímicos, orgánicos e inorgánicos que se encuentran comúnmente en muestras complejas de origen ambiental y biológico. Por lo tanto, LC-MS puede aplicarse en una amplia gama de sectores que incluyen la biotecnología , el monitoreo ambiental, el procesamiento de alimentos y las industrias farmacéutica , agroquímica y cosmética . [4] [5] Desde principios de la década de 2000, la LC-MS (o más específicamente la LC- MS-MS ) también ha comenzado a utilizarse en aplicaciones clínicas. [6]
Además de los dispositivos de cromatografía líquida y espectrometría de masas, un sistema LC-MS contiene una interfaz que transfiere eficientemente los componentes separados de la columna LC a la fuente de iones MS. [5] [7] La interfaz es necesaria porque los dispositivos LC y MS son fundamentalmente incompatibles. Mientras que la fase móvil de un sistema LC es un líquido presurizado, los analizadores MS suelen funcionar en alto vacío. Por lo tanto, no es posible bombear directamente el eluato de la columna LC a la fuente MS. En general, la interfaz es una parte mecánicamente simple del sistema LC-MS que transfiere la cantidad máxima de analito, elimina una porción significativa de la fase móvil utilizada en LC y preserva la identidad química de los productos de cromatografía (químicamente inertes). Como requisito, la interfaz no debe interferir con la eficiencia ionizante y las condiciones de vacío del sistema MS. [5] Hoy en día, las interfaces LC-MS más aplicadas se basan en estrategias de ionización a presión atmosférica (API), como la ionización por electropulverización (ESI), la ionización química a presión atmosférica (APCI) y la fotoionización a presión atmosférica (APPI). Estas interfaces estuvieron disponibles en la década de 1990, después de un proceso de investigación y desarrollo de dos décadas de duración. [8] [7]
El acoplamiento de la cromatografía con la EM es una estrategia de análisis químico bien desarrollada que se remonta a la década de 1950. La cromatografía de gases (GC)-MS se introdujo originalmente en 1952, cuando AT James y AJP Martin intentaban desarrollar técnicas de análisis de masas y separación en tándem. [9] En GC, los analitos se eluyen de la columna de separación como un gas y la conexión con fuentes de iones de ionización electrónica ( EI ) o ionización química ( CI ) en el sistema MS fue un desafío técnicamente más simple. Debido a esto, el desarrollo de los sistemas GC-MS fue más rápido que el de LC-MS y dichos sistemas se comercializaron por primera vez en la década de 1970. [7] El desarrollo de sistemas LC-MS tomó más tiempo que el GC-MS y estuvo directamente relacionado con el desarrollo de interfaces adecuadas. Victor Talrose y sus colaboradores en Rusia comenzaron el desarrollo de LC-MS a finales de la década de 1960, [10] [11] cuando utilizaron por primera vez capilares para conectar columnas LC a una fuente de EI. [12] [8] McLafferty y sus colaboradores investigaron una estrategia similar en 1973, quienes acoplaron la columna LC a una fuente de CI, [13] lo que permitió un mayor flujo de líquido hacia la fuente. Esta fue la primera y más obvia forma de acoplar LC con MS, y se conocía como interfaz de entrada capilar. Esta interfaz pionera para LC-MS tenía las mismas capacidades de análisis que GC-MS y estaba limitada a analitos bastante volátiles y compuestos no polares con baja masa molecular (por debajo de 400 Da). En la interfaz de entrada del capilar, la evaporación de la fase móvil dentro del capilar fue uno de los principales problemas. Durante los primeros años de desarrollo de LC-MS, se propusieron alternativas en línea y fuera de línea como alternativas de acoplamiento. En general, el acoplamiento fuera de línea implicó la recolección de fracciones, la evaporación del disolvente y la transferencia de analitos al MS utilizando sondas. El proceso de tratamiento de analitos fuera de línea consumía mucho tiempo y existía un riesgo inherente de contaminación de la muestra. Rápidamente se comprendió que el análisis de mezclas complejas requeriría el desarrollo de una solución de acoplamiento en línea totalmente automatizada en LC-MS. [8]
La clave del éxito y la adopción generalizada de LC-MS como herramienta analítica de rutina radica en la interfaz y la fuente de iones entre la LC de base líquida y la MS de vacío. Las siguientes interfaces fueron peldaños en el camino hacia las interfaces modernas de ionización a presión atmosférica y se describen por interés histórico.
La interfaz de correa móvil (MBI) fue desarrollada por McFadden et al. en 1977 y comercializado por Finnigan. [14] Esta interfaz consistía en una cinta móvil sin fin sobre la cual se depositaba en una banda el efluente de la columna LC. En la cinta, el disolvente se evaporó calentando suavemente y agotando eficientemente los vapores del disolvente a presión reducida en dos cámaras de vacío. Después de eliminar la fase líquida, la cinta pasó sobre un calentador que desorbió instantáneamente los analitos en la fuente de iones MS. Una de las ventajas importantes del MBI fue su compatibilidad con una amplia gama de condiciones cromatográficas. [8] MBI se utilizó con éxito para aplicaciones LC-MS entre 1978 y 1990 porque permitió el acoplamiento de dispositivos LC a MS utilizando fuentes de iones EI, CI y bombardeo de átomos rápidos (FAB). Los sistemas MS más comunes conectados mediante interfaces MBI a columnas LC fueron los instrumentos de sector magnético y cuadrupolo . Las interfaces MBI para LC-MS permitieron que la MS se aplicara ampliamente en el análisis de fármacos, pesticidas, esteroides, alcaloides e hidrocarburos aromáticos policíclicos . Esta interfaz ya no se utiliza debido a su complejidad mecánica y las dificultades asociadas con la renovación (o limpieza) de la correa, así como su incapacidad para manejar biomoléculas muy lábiles.
La interfaz de introducción directa de líquido (DLI) se desarrolló en 1980. Esta interfaz estaba destinada a resolver el problema de la evaporación del líquido dentro de la interfaz de entrada capilar. En DLI, una pequeña porción del flujo de LC se forzó a través de una pequeña abertura o diafragma (normalmente de 10 μm de diámetro) para formar un chorro de líquido compuesto de pequeñas gotas que posteriormente se secaron en una cámara de desolvatación. [11] Los analitos se ionizaron utilizando una fuente de ionización química asistida por solvente, donde los solventes LC actuaron como gases reactivos. Para utilizar esta interfaz, fue necesario dividir el flujo que salía de la columna LC porque solo una pequeña porción del efluente (10 a 50 μl/min de 1 ml/min) podía introducirse en la fuente sin aumentar el vacío. La presión del sistema MS es demasiado alta. Alternativamente, Henion de la Universidad de Cornell tuvo éxito con el uso de métodos de LC con microperforación para poder utilizar todo el flujo (bajo) de la LC. Uno de los principales problemas operativos de la interfaz DLI fue la frecuente obstrucción de los orificios del diafragma. La interfaz DLI se utilizó entre 1982 y 1985 para el análisis de pesticidas, corticosteroides, metabolitos en orina de caballo, eritromicina y vitamina B 12 . Sin embargo, esta interfaz fue reemplazada por la interfaz de termopulverización , que eliminó las limitaciones de caudal y los problemas con los diafragmas obstruidos. [5] [8]
Un dispositivo relacionado fue la interfaz de haz de partículas (PBI), desarrollada por Willoughby y Browner en 1984. [15] Las interfaces de haz de partículas asumieron las amplias aplicaciones de MBI para LC-MS en 1988. [8] [16] La PBI operada por usando un nebulizador de gas helio para rociar el eluyente al vacío, secando las gotas y bombeando el vapor de solvente (usando un separador de chorro) mientras la corriente de partículas secas monodispersas que contenían el analito ingresaba a la fuente. [11] Secar las gotas fuera del volumen de la fuente y usar un separador de chorro para bombear el vapor del solvente permitió que las partículas ingresaran y se vaporizaran en una fuente de EI de baja presión. Al igual que con el MBI, la capacidad de generar espectros EI con capacidad de búsqueda en la biblioteca fue una clara ventaja para muchas aplicaciones. Comercializado por Hewlett Packard , y más tarde por VG y Extrel, disfrutó de un éxito moderado, pero ha sido suplantado en gran medida por las interfaces de presión atmosférica como el electrospray y APCI, que proporcionan una gama más amplia de cobertura y aplicaciones de compuestos.
La interfaz de termopulverización (TSP) fue desarrollada en 1980 por Marvin Vestal y sus compañeros de trabajo en la Universidad de Houston. [17] Fue comercializado por Vestec y varios de los principales fabricantes de espectrómetros de masas. La interfaz fue el resultado de un proyecto de investigación a largo plazo destinado a encontrar una interfaz LC-MS capaz de manejar caudales elevados (1 ml/min) y evitar la división del flujo en las interfaces DLI. La interfaz TSP estaba compuesta por una sonda calentada, una cámara de desolvatación y un skimmer de enfoque iónico. El efluente de LC pasó a través de la sonda calentada y emergió como un chorro de vapor y pequeñas gotas que fluyeron hacia la cámara de desolvatación a baja presión. Inicialmente operado con un filamento o descarga como fuente de iones (actuando así como fuente de CI para el analito vaporizado), pronto se descubrió que también se observaban iones cuando el filamento o la descarga estaban apagados. Esto podría atribuirse a la emisión directa de iones de las gotas de líquido a medida que se evaporaban en un proceso relacionado con la ionización por electropulverización o la evaporación de iones, o a la ionización química de moléculas de analito vaporizadas a partir de iones tampón (como el acetato de amonio). El hecho de que se observaran iones con carga múltiple en algunos analitos más grandes sugiere que la emisión directa de iones del analito estaba ocurriendo al menos en algunas condiciones. [11] La interfaz era capaz de manejar hasta 2 ml/min de eluato de la columna LC y lo introduciría eficientemente en el sistema de vacío MS. TSP también era más adecuado para aplicaciones LC-MS que implican cromatografía líquida de fase reversa (RT-LC). Con el tiempo, la complejidad mecánica de TSP se simplificó y esta interfaz se hizo popular como la primera interfaz LC-MS ideal para aplicaciones farmacéuticas que comprenden el análisis de fármacos , metabolitos, conjugados, nucleósidos , péptidos , productos naturales y pesticidas . La introducción de TSP marcó una mejora significativa para los sistemas LC-MS y fue la interfaz más aplicada hasta principios de la década de 1990, cuando comenzó a ser reemplazada por interfaces que implicaban ionización a presión atmosférica (API). [5] [7] [16]
Las interfaces de bombardeo atómico rápido con frita ( FAB ) y de flujo continuo-FAB (CF-FAB) se desarrollaron en 1985 y 1986 respectivamente. [16] Ambas interfaces eran similares, pero se diferenciaban en que la primera usaba una sonda de frita porosa como canal de conexión, mientras que CF-FAB usaba una punta de sonda. De estos, el CF-FAB tuvo más éxito como interfaz LC-MS y fue útil para analizar compuestos no volátiles y térmicamente lábiles. En estas interfaces, el efluente de LC pasó a través de los canales de frita o CF-FAB para formar una película líquida uniforme en la punta. Allí, el líquido era bombardeado con haces de iones o átomos de alta energía (átomos rápidos). Para un funcionamiento estable, las interfaces basadas en FAB pudieron manejar caudales de líquido de solo 1 a 15 μl y también estaban restringidas a columnas capilares y de microcalibre. Para poder utilizarlos en fuentes de ionización FAB MS, los analitos de interés debían mezclarse con una matriz (p. ej., glicerol) que pudiera agregarse antes o después de la separación en la columna LC. Las interfaces basadas en FAB se utilizaron ampliamente para caracterizar péptidos, pero perdieron aplicabilidad con la llegada de las interfaces basadas en electrospray en 1988. [5] [8]
La cromatografía líquida es un método de separación física en el que los componentes de una mezcla líquida se distribuyen entre dos fases inmiscibles, es decir, estacionaria y móvil. La práctica de la LC se puede dividir en cinco categorías, es decir, cromatografía de adsorción , cromatografía de partición , cromatografía de intercambio iónico , cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de afinidad . Entre ellas, la variante más utilizada es el modo de fase inversa (RP) de la técnica de cromatografía de partición, que utiliza una fase estacionaria no polar (hidrófoba) y una fase móvil polar. En aplicaciones comunes, la fase móvil es una mezcla de agua y otros disolventes polares (p. ej., metanol, isopropanol y acetonitrilo), y la matriz estacionaria se prepara uniendo grupos alquilo de cadena larga (p. ej., n-octadecilo o C18 ) a las superficies externa e interna de partículas de sílice porosas de 5 µm de diámetro de forma irregular o esférica. [5]
En HPLC, normalmente se inyectan 20 µl de la muestra de interés en la corriente de fase móvil suministrada por una bomba de alta presión. La fase móvil que contiene los analitos atraviesa el lecho de la fase estacionaria en una dirección definida. Los componentes de la mezcla se separan en función de su afinidad química con las fases móvil y estacionaria. La separación se produce después de repetidas etapas de sorción y desorción que se producen cuando el líquido interactúa con el lecho estacionario. [8] El disolvente líquido (fase móvil) se suministra a alta presión (hasta 400 bar o 5800 psi) a una columna empaquetada que contiene la fase estacionaria. La alta presión es necesaria para lograr un caudal constante para experimentos de cromatografía reproducibles. Dependiendo de la partición entre las fases móvil y estacionaria, los componentes de la muestra saldrán de la columna en diferentes momentos. [16] La columna es el componente más importante del sistema LC y está diseñada para soportar la alta presión del líquido. Las columnas LC convencionales tienen una longitud de 100 a 300 mm, un diámetro exterior de 6,4 mm (1/4 de pulgada) y un diámetro interno de 3,0 a 4,6 mm. Para aplicaciones que involucran LC-MS, la longitud de las columnas de cromatografía puede ser más corta (30 a 50 mm) con partículas de relleno de 3 a 5 μm de diámetro. Además del modelo convencional, otras columnas LC son los modelos de calibre estrecho, microcapilar, microcapilar y nano-LC. Estas columnas tienen diámetros internos más pequeños, permiten una separación más eficiente y manejan flujos de líquido inferiores a 1 ml/min (el caudal convencional). [8] Para mejorar la eficiencia de la separación y la resolución máxima, se puede utilizar cromatografía líquida de ultra rendimiento (UHPLC) en lugar de HPLC. Esta variante de LC utiliza columnas empaquetadas con partículas de sílice más pequeñas (~1,7 μm de diámetro) y requiere presiones de funcionamiento más altas en el rango de 310 000 a 775 000 torr (6000 a 15 000 psi, 400 a 1034 bar). [5]
La espectrometría de masas (MS) es una técnica analítica que mide la relación masa-carga ( m/z) de partículas cargadas (iones). Aunque existen muchos tipos diferentes de espectrómetros de masas, todos utilizan campos eléctricos o magnéticos para manipular el movimiento de los iones producidos a partir de un analito de interés y determinar su m/z. [18] Los componentes básicos de un espectrómetro de masas son la fuente de iones , el analizador de masas , el detector y los sistemas de datos y de vacío. La fuente de iones es donde los componentes de una muestra introducida en un sistema MS se ionizan mediante haces de electrones , haces de fotones ( luces UV ), rayos láser o descarga de corona . En el caso de la ionización por electropulverización, la fuente de iones mueve los iones que existen en la solución líquida a la fase gaseosa. La fuente de iones convierte y fragmenta las moléculas de muestra neutras en iones en fase gaseosa que se envían al analizador de masas. Mientras el analizador de masas aplica los campos eléctrico y magnético para clasificar los iones por sus masas, el detector mide y amplifica la corriente iónica para calcular la abundancia de cada ion con resolución de masa. Para generar un espectro de masas que el ojo humano pueda reconocer fácilmente, el sistema de datos registra, procesa, almacena y muestra datos en una computadora. [5]
El espectro de masas se puede utilizar para determinar la masa de los analitos, su composición elemental e isotópica o para dilucidar la estructura química de la muestra. [5] MS es un experimento que debe realizarse en fase gaseosa y al vacío (1,33 * 10 −2 a 1,33 * 10 −6 pascal). Por tanto, el desarrollo de dispositivos que faciliten la transición de muestras a mayor presión y en fase condensada (sólida o líquida) a un sistema de vacío ha sido esencial para desarrollar la EM como una potente herramienta para la identificación y cuantificación de compuestos orgánicos como péptidos. [19] La EM es ahora de uso muy común en laboratorios analíticos que estudian las propiedades físicas, químicas o biológicas de una gran variedad de compuestos. Entre los muchos tipos diferentes de analizadores de masas, los que encuentran aplicación en los sistemas LC-MS son los analizadores de cuadrupolo , tiempo de vuelo (TOF) , trampas de iones y analizadores híbridos de cuadrupolo-TOF (QTOF) . [7]
La interfaz entre una técnica en fase líquida (HPLC) con un eluido que fluye continuamente y una técnica en fase gaseosa realizada al vacío fue difícil durante mucho tiempo. La llegada de la ionización por electropulverización cambió esto. Actualmente, las interfaces LC-MS más comunes son la ionización por electropulverización (ESI), la ionización química a presión atmosférica (APCI) y la fotoionización a presión atmosférica (APPI). Se trata de fuentes de iones de MS más nuevas que facilitan la transición de un entorno de alta presión (HPLC) a las condiciones de alto vacío necesarias en el analizador de MS. [20] [7] Aunque estas interfaces se describen individualmente, también pueden estar disponibles comercialmente como fuentes de iones duales ESI/APCI, ESI/APPI o APCI/APPI. [8] En el pasado se utilizaron varias técnicas de deposición y secado (por ejemplo, correas móviles), pero la más común de ellas fue la deposición MALDI fuera de línea . [21] [22] Un nuevo enfoque aún en desarrollo llamado interfaz LC-MS EI directa, combina un sistema nano HPLC y un espectrómetro de masas equipado con ionización electrónica. [23] [24]
La interfaz ESI para sistemas LC-MS fue desarrollada por Fenn y sus colaboradores en 1988. [25] Esta fuente/interfaz de iones se puede utilizar para el análisis de moléculas moderadamente polares e incluso muy polares (p. ej., metabolitos, xenobióticos, péptidos, nucleótidos, polisacáridos). ). El eluato líquido que sale de la columna LC se dirige a un capilar metálico mantenido entre 3 y 5 kV y se nebuliza mediante un flujo coaxial de gas de alta velocidad en la punta del capilar, creando una fina pulverización de gotas cargadas delante de la entrada a la cámara de vacío. Para evitar la contaminación del sistema de vacío por tampones y sales, este capilar suele estar situado perpendicularmente a la entrada del sistema MS, en algunos casos con una contracorriente de nitrógeno seco delante de la entrada por donde son dirigidos los iones por el sistema eléctrico. campo. En algunas fuentes, la rápida evaporación de las gotas y, por tanto, la máxima emisión de iones, se logra mezclando una corriente adicional de gas caliente con la columna de pulverización frente a la entrada de vacío. En otras fuentes, las gotitas pasan a través de un tubo capilar calentado cuando entran al vacío, lo que promueve la evaporación de las gotitas y la emisión de iones. Estos métodos para aumentar la evaporación de las gotas ahora permiten el uso de caudales de líquido de 1 a 2 ml/min sin dejar de lograr una ionización eficiente [26] y una alta sensibilidad. Por lo tanto, si bien el uso de columnas con microdiámetro de 1 a 3 mm y caudales más bajos de 50 a 200 μl/min se consideraban comúnmente necesarios para un funcionamiento óptimo, esta limitación ya no es tan importante y ahora se puede aprovechar la mayor capacidad de las columnas de mayor diámetro. empleado ventajosamente con sistemas ESI LC-MS. Se pueden crear iones con carga positiva y negativa cambiando las polaridades, y es posible adquirir espectros alternos en modo positivo y negativo rápidamente dentro de la misma serie de LC. Mientras que la mayoría de las moléculas grandes (mayores que MW 1500-2000) producen iones con carga múltiple en la fuente ESI, la mayoría de las moléculas más pequeñas producen iones con carga única. [7]
El desarrollo de la interfaz APCI para LC-MS comenzó con Horning y sus colaboradores a principios de 1973. [27] Sin embargo, su aplicación comercial se introdujo a principios de la década de 1990 después de que Henion y sus colaboradores mejoraran la interfaz LC-APCI-MS en 1986. [8] La fuente/interfaz de iones APCI se puede utilizar para analizar moléculas pequeñas, neutras, relativamente no polares y térmicamente estables (por ejemplo, esteroides, lípidos y vitaminas liposolubles) . Estos compuestos no se ionizan bien usando ESI. Además, APCI también puede manejar flujos de fase móvil que contienen agentes tampón. El líquido del sistema LC se bombea a través de un capilar y también se nebuliza en la punta, donde se produce una descarga en corona. Primero, el gas ionizante que rodea la interfaz y el disolvente de la fase móvil están sujetos a ionización química en la fuente de iones. Posteriormente, estos iones reaccionan con el analito y transfieren su carga. Luego, los iones de la muestra pasan a través de pequeños orificios mediante skimmers mediante lentes de enfoque iónico. Una vez dentro de la región de alto vacío, los iones están sujetos a análisis de masas. Esta interfaz puede funcionar en modos de carga positiva y negativa y se producen principalmente iones con carga única. [7] La fuente de iones APCI también puede manejar caudales entre 500 y 2000 μl/min y se puede conectar directamente a columnas convencionales de 4,6 mm de diámetro interior. [dieciséis]
La interfaz APPI para LC-MS fue desarrollada simultáneamente por Bruins y Syage en 2000. [28] [8] APPI es otra fuente/interfaz de iones LC-MS para el análisis de compuestos neutros que no pueden ionizarse utilizando ESI. [7] Esta interfaz es similar a la fuente de iones APCI, pero en lugar de una descarga en corona, la ionización se produce mediante el uso de fotones provenientes de una lámpara de descarga. En el modo APPI directo, los iones moleculares de analito con carga única se forman mediante la absorción de un fotón y la expulsión de un electrón. En el modo dopante-APPI, se añade un compuesto fácilmente ionizable (Dopant) a la fase móvil o al gas nebulizador para promover una reacción de intercambio de carga entre el ion molecular dopante y el analito. Posteriormente, la muestra ionizada se transfiere al analizador de masas en alto vacío mientras pasa a través de pequeños orificios. [8]
El acoplamiento de MS con sistemas LC es atractivo porque la cromatografía líquida puede separar mezclas naturales delicadas y complejas, cuya composición química debe estar bien establecida (por ejemplo, fluidos biológicos, muestras ambientales y medicamentos). Además, la LC-MS tiene aplicaciones en el análisis de residuos explosivos volátiles. [29] Hoy en día, LC-MS se ha convertido en una de las técnicas de análisis químico más utilizadas porque más del 85% de los compuestos químicos naturales son polares y térmicamente lábiles y GC-MS no puede procesar estas muestras. [5] A modo de ejemplo, HPLC-MS se considera la técnica analítica líder para laboratorios de proteómica y farmacéuticos. [7] [5] Otras aplicaciones importantes de LC-MS incluyen el análisis de alimentos, pesticidas y fenoles vegetales . [8]
La LC-MS se utiliza ampliamente en el campo del bioanálisis y está especialmente involucrada en estudios farmacocinéticos de productos farmacéuticos. Se necesitan estudios farmacocinéticos para determinar la rapidez con la que un fármaco se eliminará de los órganos del cuerpo y del flujo sanguíneo hepático. Los analizadores de MS son útiles en estos estudios debido a su tiempo de análisis más corto y a su mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los detectores UV comúnmente conectados a los sistemas HPLC. Una ventaja importante es el uso de MS-MS en tándem , donde el detector puede programarse para seleccionar ciertos iones para fragmentar. La cantidad medida es la suma de fragmentos de moléculas elegidos por el operador. Siempre que no haya interferencias o supresión de iones en LC-MS , la separación por LC puede ser bastante rápida. [30]
La LC-MS se utiliza en proteómica como método para detectar e identificar los componentes de una mezcla compleja. El enfoque LC-MS de proteómica ascendente generalmente implica digestión y desnaturalización con proteasa utilizando tripsina como proteasa, urea para desnaturalizar la estructura terciaria y yodoacetamida para modificar los residuos de cisteína. Después de la digestión, se utiliza LC-MS para determinar la masa peptídica , o se utiliza LC-MS/MS ( MS en tándem ) para derivar las secuencias de péptidos individuales. [31] La LC-MS/MS se utiliza más comúnmente para el análisis proteómico de muestras complejas donde las masas de péptidos pueden superponerse incluso con una espectrometría de masas de alta resolución. Se pueden analizar muestras de compuestos biológicos complejos (p. ej., suero humano) en modernos sistemas LC-MS/MS, que pueden identificar más de 1.000 proteínas. Sin embargo, este alto nivel de identificación de proteínas sólo es posible después de separar la muestra mediante gel SDS-PAGE o HPLC-SCX. [30] Recientemente, la LC-MS/MS se ha aplicado para buscar biomarcadores peptídicos. Algunos ejemplos son el reciente descubrimiento y validación de biomarcadores peptídicos para cuatro patógenos bacterianos principales del tracto respiratorio ( Staphylococcus aureus , Moraxella catarrhalis ; Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae ) y el virus SARS-CoV-2. [32] [33]
La LC-MS se ha convertido en una de las técnicas más utilizadas en el perfilado global de metabolitos del tejido biológico (p. ej., plasma sanguíneo, suero, orina). [34] La LC-MS también se utiliza para el análisis de productos naturales y la elaboración de perfiles de metabolitos secundarios en plantas. [35] En este sentido, los sistemas basados en MS son útiles para adquirir información más detallada sobre el amplio espectro de compuestos de muestras biológicas complejas. La resonancia magnética nuclear ( RMN ) LC también se utiliza en la metabolómica de las plantas, pero esta técnica sólo puede detectar y cuantificar los metabolitos más abundantes. La LC-MS ha sido útil para avanzar en el campo de la metabolómica vegetal, cuyo objetivo es estudiar el sistema vegetal a nivel molecular proporcionando una caracterización imparcial del metaboloma vegetal en respuesta a su entorno. [36] La primera aplicación de LC-MS en la metabolómica de las plantas fue la detección de una amplia gama de metabolitos, oligosacáridos , aminoácidos , aminoazúcares y nucleótidos de azúcares altamente polares de los tejidos del floema de Cucurbita maxima . [37] Otro ejemplo de LC-MS en la metabolómica de las plantas es la separación e identificación eficiente de glucosa , sacarosa , rafinosa , estaquiosa y verbascosa de extractos de hojas de Arabidopsis thaliana . [38]
La LC-MS se utiliza con frecuencia en el desarrollo de fármacos porque permite una rápida confirmación del peso molecular y la identificación de la estructura. Estas características aceleran el proceso de generación, prueba y validación de un descubrimiento a partir de una amplia gama de productos con posible aplicación. Las aplicaciones de LC-MS para el desarrollo de fármacos son métodos altamente automatizados que se utilizan para el mapeo de péptidos, el mapeo de glicoproteínas , la lipodomía, la desreplicación de productos naturales, la detección de bioafinidad, la detección de fármacos in vivo , la detección de estabilidad metabólica, la identificación de metabolitos, la identificación de impurezas, el bioanálisis cuantitativo y el control de calidad. [39]
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