La cromatografía líquida micelar ( MLC ) es una forma de cromatografía líquida de fase inversa que utiliza soluciones micelares acuosas como fase móvil. [1]
El uso de micelas en cromatografía líquida de alto rendimiento fue introducido por primera vez por Armstrong y Henry en 1980. [2] [3] La técnica se utiliza principalmente para mejorar la retención y selectividad de varios solutos que de otro modo serían inseparables o se resolverían mal. La cromatografía líquida micelar (MLC) se ha utilizado en una variedad de aplicaciones, incluida la separación de mezclas de solutos cargados y neutros, la inyección directa de suero y otros fluidos fisiológicos, el análisis de compuestos farmacéuticos , la separación de enantiómeros , el análisis de organometálicos inorgánicos y una serie de otros.
Uno de los principales inconvenientes de la técnica es la eficiencia reducida que provocan las micelas. A pesar de la eficiencia a veces baja, la MLC es una mejor opción que la LC de intercambio iónico o la LC de apareamiento iónico para la separación de moléculas cargadas y mezclas de especies cargadas y neutras . [1] Algunos de los aspectos que se discutirán son los aspectos teóricos de la MLC, el uso de modelos para predecir las características retentivas de la MLC, el efecto de las micelas en la eficiencia y la selectividad, y las aplicaciones generales de la MLC.
La cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) implica una fase estacionaria no polar , a menudo una cadena de hidrocarburos , y una fase móvil o líquida polar. La fase móvil generalmente consta de una porción acuosa con una adición orgánica, como metanol o acetonitrilo . Cuando se inyecta una solución de analitos en el sistema, los componentes comienzan a separarse de la fase móvil e interactúan con la fase estacionaria. Cada componente interactúa con la fase estacionaria de una manera diferente dependiendo de su polaridad e hidrofobicidad . En la HPLC de fase inversa, el soluto con la mayor polaridad interactuará menos con la fase estacionaria y pasará más tiempo en la fase móvil. A medida que disminuye la polaridad de los componentes, aumenta el tiempo que pasan en la columna. Por lo tanto, se logra una separación de componentes basada en la polaridad. [4] La adición de micelas a la fase móvil introduce una tercera fase en la que los solutos pueden dividirse.
Las micelas están compuestas de monómeros de surfactante o detergente con una porción hidrofóbica , o cola, en un extremo, y una porción hidrofílica , o grupo de cabeza, en el otro. El grupo de cabeza polar puede ser aniónico , catiónico , zwitteriónico o no iónico. Cuando la concentración de un surfactante en solución alcanza su concentración micelar crítica (CMC), forma micelas que son agregados de los monómeros. La CMC es diferente para cada surfactante, al igual que el número de monómeros que componen la micela, denominado número de agregación (AN). [5] La Tabla 1 enumera algunos detergentes comunes utilizados para formar micelas junto con su CMC y AN cuando estén disponibles.
Muchas de las características de las micelas difieren de las de los disolventes a granel. Por ejemplo, las micelas son, por naturaleza, espacialmente heterogéneas con un núcleo de hidrocarburo, casi anhidro y un grupo de cabeza polar altamente solvatado . Tienen una alta relación superficie-volumen debido a su pequeño tamaño y forma generalmente esférica . Su entorno circundante ( pH , fuerza iónica, ion tampón, presencia de un codisolvente y temperatura ) tiene una influencia en su tamaño, forma, concentración micelar crítica, número de agregación y otras propiedades. [6]
Otra propiedad importante de las micelas es el punto Kraft, la temperatura a la que la solubilidad del surfactante es igual a su CMC. Para aplicaciones de HPLC que involucran micelas, es mejor elegir un surfactante con un punto Kraft y CMC bajos. Un CMC alto requeriría una alta concentración de surfactante que aumentaría la viscosidad de la fase móvil, una condición indeseable. Además, un punto Kraft debe estar muy por debajo de la temperatura ambiente para evitar tener que aplicar calor a la fase móvil. Para evitar posibles interferencias con los detectores de absorción, un surfactante también debe tener una pequeña absortividad molar en la longitud de onda elegida para el análisis. La dispersión de la luz no debería ser una preocupación debido al pequeño tamaño, unos pocos nanómetros , de la micela. [1]
El efecto de los aditivos orgánicos sobre las propiedades micelares es otra consideración importante. A menudo se añade una pequeña cantidad de disolvente orgánico a la fase móvil para ayudar a mejorar la eficiencia y mejorar la separación de compuestos. Se debe tener cuidado al determinar la cantidad de disolvente orgánico que se debe añadir. Una concentración demasiado alta de disolvente orgánico puede hacer que la micela se disperse, ya que depende de los efectos hidrofóbicos para su formación. La concentración máxima de disolvente orgánico depende del propio disolvente orgánico y de la micela. Esta información no suele conocerse con precisión, pero una práctica generalmente aceptada es mantener el porcentaje de volumen de disolvente orgánico por debajo del 15-20 %. [1]
Fischer y Jandera [7] estudiaron el efecto de cambiar la concentración de metanol en los valores de CMC para tres surfactantes comúnmente utilizados. Dos catiónicos, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), y bromuro de N-(a-carbetoxipentadecil) trimetilamonio ( Septonex ), y un surfactante aniónico, dodecil sulfato de sodio (SDS) fueron elegidos para el experimento. En términos generales, la CMC aumentó a medida que aumentó la concentración de metanol. Luego se concluyó que la distribución del surfactante entre la fase móvil a granel y la fase micelar se desplaza hacia la masa a medida que aumenta la concentración de metanol. Para CTAB, el aumento en CMC es mayor de 0 a 10% de metanol, y es casi constante de 10 a 20%. Por encima del 20% de metanol, las micelas se desagregan y no existen. Para SDS, los valores de CMC permanecen inalterados por debajo del 10% de metanol, pero comienzan a aumentar a medida que aumenta aún más la concentración de metanol. La desagregación se produce por encima del 30% de metanol. Por último, en el caso de Septonex, solo se observa un ligero aumento de la CMC hasta el 20%, produciéndose desagregación por encima del 25%. [7]
Como se ha afirmado, la fase móvil en MLC consiste en micelas en un disolvente acuoso , generalmente con una pequeña cantidad de modificador orgánico añadido para completar la fase móvil. Se utiliza una fase estacionaria típica con enlaces alquílicos en fase inversa. La primera discusión de la termodinámica involucrada en el mecanismo de retención fue publicada por Armstrong y Nome en 1981. [8] En MLC, hay tres coeficientes de partición que deben tenerse en cuenta. El soluto se repartirá entre el agua y la fase estacionaria (KSW), el agua y las micelas (KMW) y las micelas y la fase estacionaria (KSM).
Armstrong y Nome derivaron una ecuación que describe los coeficientes de partición en términos del factor de retención , formalmente factor de capacidad, k¢. En HPLC, el factor de capacidad representa la relación molar del soluto en la fase estacionaria con la fase móvil. El factor de capacidad se mide fácilmente en función de los tiempos de retención del compuesto y de cualquier compuesto no retenido. La ecuación reescrita por Guermouche et al. [9] se presenta aquí:
Dónde:
Una gráfica de 1/k¢ versus CM da una línea recta en la que KSW se puede calcular a partir de la intersección y KMW se puede obtener a partir de la relación entre la pendiente y la intersección. Finalmente, KSM se puede obtener a partir de la relación entre los otros dos coeficientes de partición:
Como se puede observar en la Figura 1, KMW es independiente de cualquier efecto de la fase estacionaria, asumiendo la misma fase móvil micelar. [9]
La validez del mecanismo de retención propuesto por Armstrong y Nome ha sido confirmada experimentalmente de forma exitosa y repetida. Sin embargo, también se han propuesto algunas variaciones y teorías alternativas. Jandera y Fischer [10] desarrollaron ecuaciones para describir la dependencia del comportamiento de retención con respecto al cambio en las concentraciones micelares. Encontraron que la retención de la mayoría de los compuestos evaluados disminuía con el aumento de las concentraciones de micelas. A partir de esto, se puede suponer que los compuestos se asocian con las micelas a medida que pasan menos tiempo asociados con la fase estacionaria. [10]
Foley propuso un modelo retentivo similar al de Armstrong y Nome, que era un modelo general para los equilibrios químicos secundarios en cromatografía líquida. [11] Si bien este modelo se desarrolló en una referencia anterior y podría usarse para cualquier equilibrio químico secundario , como equilibrios ácido-base y apareamiento iónico, Foley refinó aún más el modelo para MLC. Cuando se agrega un equilibrante (X), en este caso surfactante, a la fase móvil, se crea un equilibrio secundario en el que un analito existirá como analito libre (A) y complejado con el equilibrante (AX). Las dos formas serán retenidas por la fase estacionaria en diferentes grados, lo que permite variar la retención ajustando la concentración de equilibrante (micelas). [11]
La ecuación resultante resuelta para el factor de capacidad en términos de coeficientes de partición es muy similar a la de Armstrong y Nome:
Dónde:
Foley utilizó la ecuación anterior para determinar las constantes de asociación soluto-micela y los factores de retención de soluto libre para una variedad de solutos con diferentes surfactantes y fases estacionarias. A partir de estos datos, es posible predecir el tipo y las concentraciones óptimas de surfactante necesarias para un soluto o solutos determinados. [11]
Foley no ha sido el único investigador interesado en determinar las constantes de asociación soluto-micela. Un artículo de revisión de Marina y García con 53 referencias discute la utilidad de obtener constantes de asociación soluto-micela. [12] Las constantes de asociación para dos solutos pueden usarse para ayudar a entender el mecanismo de retención. El factor de separación de dos solutos, a, puede expresarse como KSM1/KSM2. Si el a experimental coincide con la relación de los dos coeficientes de partición soluto-micela, puede asumirse que su retención ocurre a través de una transferencia directa de la fase micelar a la fase estacionaria. Además, el cálculo de a permitiría predecir la selectividad de la separación antes de realizar el análisis, siempre que se conozcan los dos coeficientes. [12]
El deseo de predecir el comportamiento de retención y la selectividad ha llevado al desarrollo de varios modelos matemáticos. [13] Los cambios en el pH, la concentración de surfactante y la concentración de modificador orgánico juegan un papel importante en la determinación de la separación cromatográfica. A menudo, uno o más de estos parámetros deben optimizarse para lograr la separación deseada, aunque los parámetros óptimos deben tener en cuenta las tres variables simultáneamente. La revisión de García-Álvarez-Coque et al. mencionó varios modelos exitosos para diferentes escenarios, algunos de los cuales se mencionarán aquí. Los modelos clásicos de Armstrong y Nome y Foley se utilizan para describir los casos generales. El modelo de Foley se aplica a muchos casos y se ha verificado experimentalmente para solutos iónicos, neutros, polares y no polares; surfactantes aniónicos, catiónicos y no iónicos, y fases estacionarias C8, C¬18 y ciano . El modelo comienza a desviarse para solutos de alta y baja retención. Los solutos altamente retenidos pueden unirse irreversiblemente a la fase estacionaria, donde los solutos poco retenidos pueden eluir en el volumen vacío de la columna. [13]
Otros modelos propuestos por Arunyanart y Cline-Love y Rodgers y Khaledi describen el efecto del pH en la retención de ácidos y bases débiles. Estos autores derivaron ecuaciones que relacionan el pH y la concentración micelar con la retención. A medida que varía el pH, se observa un comportamiento sigmoideo para la retención de especies ácidas y básicas. Se ha demostrado que este modelo predice con precisión el comportamiento de retención. [13] Otros modelos predicen el comportamiento en sistemas micelares híbridos utilizando ecuaciones o modelando el comportamiento basado en experimentación controlada. Además, se han sugerido modelos que tienen en cuenta el efecto simultáneo del pH, la concentración micelar y orgánica. Estos modelos permiten una mayor mejora de la optimización de la separación de ácidos y bases débiles. [13]
Un grupo de investigación, Rukhadze, et al. [14] derivó una relación lineal de primer orden que describe la influencia de la concentración micelar y orgánica, y el pH en la selectividad y resolución de siete barbitúricos . Los investigadores descubrieron que una ecuación matemática de segundo orden se ajustaría con mayor precisión a los datos. Las derivaciones y los detalles experimentales están más allá del alcance de esta discusión. El modelo tuvo éxito en predecir las condiciones experimentales necesarias para lograr una separación de compuestos que tradicionalmente son difíciles de resolver. [14]
Jandera, Fischer y Effenberger abordaron el problema de modelado de otra manera. [15] El modelo utilizado se basó en los índices de lipofilicidad y polaridad de los solutos. El índice de lipofilicidad relaciona un soluto dado con un número hipotético de átomos de carbono en una cadena alquílica. Se basa y depende de una serie de calibración determinada experimentalmente. El índice de lipofilicidad debe ser independiente de la fase estacionaria y la concentración del modificador orgánico. El índice de polaridad es una medida de la polaridad de las interacciones soluto-disolvente. Depende en gran medida del disolvente orgánico y en cierta medida de los grupos polares presentes en la fase estacionaria. Se analizaron 23 compuestos con distintas fases móviles y se compararon con los índices de lipofilicidad y polaridad. Los resultados mostraron que el modelo podría aplicarse a la MLC, pero se encontró un mejor comportamiento predictivo con concentraciones de surfactante por debajo de la CMC, submicelar. [15]
Un último tipo de modelo basado en las propiedades moleculares de un soluto es una rama de las relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR). Los estudios QSAR intentan correlacionar la actividad biológica de los fármacos , o una clase de fármacos, con las estructuras. El medio normalmente aceptado de captación de un fármaco, o su metabolito, es a través de la partición en bicapas lipídicas . El descriptor más utilizado en QSAR para determinar la hidrofobicidad de un compuesto es el coeficiente de partición octanol -agua, log P. [16] La MLC proporciona una alternativa atractiva y práctica a la QSAR. Cuando se añaden micelas a una fase móvil, existen muchas similitudes entre la fase móvil/fase estacionaria micelar y la interfaz membrana/agua biológica. En la MLC, la fase estacionaria se modifica por la adsorción de monómeros surfactantes que son estructuralmente similares a las cadenas de hidrocarburos membranosos en el modelo biológico. Además, las interacciones hidrófilas/hidrófobas de las micelas son similares a las de las regiones polares de una membrana. Por lo tanto, el desarrollo de relaciones cuantitativas estructura-retención (QRAR) se ha generalizado. [17]
Escuder-Gilabert et al. [18] probaron tres modelos diferentes de retención QRAR en compuestos iónicos. Se probaron varias clases de compuestos, incluidas catecolaminas , anestésicos locales , diuréticos y aminoácidos . Se encontró que el mejor modelo que relaciona log K y log P era uno en el que se incluye como variable la carga molar total de un compuesto a un pH dado. Este modelo demostró dar predicciones bastante precisas de log P, R > 0,9. [18] Se han realizado otros estudios que desarrollan modelos predictivos QRAR para antidepresivos tricíclicos [17] y barbitúricos. [16]
La principal limitación en el uso de MLC es la reducción en la eficiencia (ensanchamiento de pico) que se observa cuando se utilizan fases móviles micelares puramente acuosas. [19] Se han teorizado varias explicaciones para la baja eficiencia. Se han postulado como posibles causas la mala humectación de la fase estacionaria por la fase móvil acuosa micelar, la transferencia de masa lenta entre las micelas y la fase estacionaria y la transferencia de masa deficiente dentro de la fase estacionaria. Para mejorar la eficiencia, los enfoques más comunes han sido la adición de pequeñas cantidades de alcohol isopropílico y el aumento de la temperatura. Una revisión de Berthod [19] estudió las teorías combinadas presentadas anteriormente y aplicó la ecuación de Knox para determinar de forma independiente la causa de la eficiencia reducida. La ecuación de Knox se utiliza comúnmente en HPLC para describir las diferentes contribuciones al ensanchamiento de banda general de un soluto. La ecuación de Knox se expresa como:
Dónde:
El uso de la ecuación de Knox por parte de Berthod para determinar experimentalmente cuál de las teorías propuestas era la más correcta lo llevó a las siguientes conclusiones. La anisotropía del flujo en la fase micelar parece ser mucho mayor que en las fases móviles hidroorgánicas tradicionales de viscosidad similar . Esto probablemente se deba a la obstrucción parcial de los poros de la fase estacionaria por las moléculas de surfactante adsorbidas. El aumento de la temperatura de la columna sirvió para disminuir la viscosidad de la fase móvil y la cantidad de surfactante adsorbido. Ambos resultados reducen el término A y la cantidad de difusión de remolinos y, por lo tanto, aumentan la eficiencia. [19]
El aumento del término B, en relación con la difusión longitudinal, está asociado con la disminución del coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil, DM, debido a la presencia de las micelas, y un aumento del factor de capacidad, k¢. Nuevamente, esto está relacionado con la adsorción del surfactante en la fase estacionaria, lo que provoca una disminución drástica del coeficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria, DS. Nuevamente, un aumento de la temperatura, ahora acoplado con una adición de alcohol a la fase móvil, disminuye drásticamente la cantidad de surfactante absorbido. A su vez, ambas acciones reducen el término C causado por una transferencia de masa lenta de la fase estacionaria a la fase móvil. Se puede lograr una mayor optimización de la eficiencia reduciendo el caudal a uno que coincida estrechamente con el derivado de la ecuación de Knox. En general, las tres teorías propuestas parecieron tener efectos contribuyentes a la baja eficiencia observada, y se pueden contrarrestar parcialmente mediante la adición de modificadores orgánicos, en particular alcohol, y el aumento de la temperatura de la columna. [19]
A pesar de la eficiencia reducida en comparación con la HPLC de fase reversa, se han reportado cientos de aplicaciones utilizando MLC. Una de las más ventajosas es la capacidad de inyectar directamente fluidos fisiológicos. Las micelas tienen la capacidad de solubilizar proteínas , lo que permite que la MLC sea útil para analizar fluidos biológicos no tratados, como plasma , suero y orina . [1] Martinez et al. [20] encontraron que la MLC es muy útil para analizar una clase de medicamentos llamados beta-antagonistas, también llamados beta-bloqueantes , en muestras de orina. La principal ventaja del uso de MLC con este tipo de muestra es el gran ahorro de tiempo en la preparación de la muestra. Los métodos alternativos de análisis, incluida la HPLC de fase reversa, requieren largos procedimientos de extracción y procesamiento de la muestra antes de que pueda comenzar el análisis. Con MLC, a menudo es posible la inyección directa, con tiempos de retención de menos de 15 minutos para la separación de hasta nueve beta-antagonistas. [20]
Otra aplicación comparó la HPLC de fase reversa con la MLC para el análisis de desferrioxamina en suero. [21] La desferrioxamina (DFO) es un fármaco de uso común para la eliminación del exceso de hierro en pacientes con niveles crónicos y agudos. El análisis de DFO junto con sus complejos quelados , Fe(III) DFO y Al (III) DFO ha demostrado ser difícil en el mejor de los casos en intentos anteriores. Este estudio encontró que la inyección directa del suero era posible para la MLC, a diferencia de un paso de ultrafiltración necesario en la HPLC. Este análisis demostró tener dificultades con la separación de los compuestos de DFO quelados y con los niveles de sensibilidad para la propia DFO cuando se aplicó la MLC. El investigador encontró que, en este caso, la HPLC de fase reversa era una técnica mejor y más sensible a pesar del ahorro de tiempo en la inyección directa. [21]
El análisis de productos farmacéuticos por MLC también está ganando popularidad. La selectividad y la forma de pico de la MLC sobre la cromatografía de pares iónicos comúnmente utilizada se mejora mucho. [22] La MLC imita, pero mejora, la selectividad ofrecida por los reactivos de apareamiento iónico para la separación de ingredientes activos en fármacos farmacéuticos . Para los fármacos básicos, la MLC mejora la cola de pico excesiva observada con frecuencia en el apareamiento iónico. Los fármacos hidrófilos a menudo no se retienen utilizando HPLC convencional, se retienen por MLC debido a la solubilización en las micelas. Los fármacos que se encuentran comúnmente en medicamentos para el resfriado, como acetaminofeno , ácido L-ascórbico , fenilpropanolamina HCL, hibenzato de tipepidina y maleato de clorfeniramina, se han separado con éxito con una buena forma de pico utilizando MLC. Otros fármacos básicos como muchos narcóticos, como la codeína y la morfina , también se han separado con éxito utilizando MLC. [22]
Otra aplicación novedosa de la cromatografía líquida de alta resolución (MLC) implica la separación y el análisis de compuestos inorgánicos , principalmente iones simples. Se trata de un área relativamente nueva para la MLC, pero ha obtenido algunos resultados prometedores. [23] Se ha observado que la MLC proporciona una mejor selectividad de iones inorgánicos que la cromatografía de intercambio iónico o de apareamiento iónico. Si bien esta aplicación aún se encuentra en las primeras etapas de desarrollo, existen posibilidades de realizar separaciones novedosas y mucho más mejoradas de especies inorgánicas. [23]
Desde que se informó por primera vez sobre esta técnica en 1980, la cromatografía líquida micelar se ha utilizado en cientos de aplicaciones. Esta técnica controlada por micelas ofrece oportunidades únicas para resolver problemas de separación complicados. A pesar de la baja eficiencia de la cromatografía líquida micelar, se ha utilizado con éxito en muchas aplicaciones. El uso de la cromatografía líquida micelar en el futuro parece ser extremadamente ventajoso en las áreas de fluidos fisiológicos, productos farmacéuticos e incluso iones inorgánicos. La técnica ha demostrado ser superior al apareamiento iónico y al intercambio iónico para muchas aplicaciones. A medida que se desarrollen nuevos enfoques para combatir la baja eficiencia de la cromatografía líquida micelar, su aplicación seguramente se extenderá y ganará más aceptación.