La cromatografía líquida de alta resolución ( HPLC ), anteriormente denominada cromatografía líquida de alta presión , es una técnica de química analítica que se utiliza para separar, identificar y cuantificar componentes específicos en mezclas. Las mezclas pueden tener su origen en alimentos , productos químicos , productos farmacéuticos , [1] biológicos , ambientales y agrícolas , etc., que se han disuelto en soluciones líquidas. [ cita requerida ]
Se basa en bombas de alta presión, que suministran mezclas de varios disolventes, llamada fase móvil , que fluye a través del sistema, recogiendo la mezcla de muestra en el camino, entregándola a un cilindro, llamado columna, lleno de partículas sólidas, hechas de material adsorbente , llamado fase estacionaria . [2]
Cada componente de la muestra interactúa de forma diferente con el material adsorbente, lo que provoca diferentes tasas de migración para cada componente. [3] Estas diferentes tasas conducen a la separación a medida que las especies fluyen fuera de la columna hacia un detector específico, como los detectores UV . La salida del detector es un gráfico, llamado cromatograma. Los cromatogramas son representaciones gráficas de la intensidad de la señal en función del tiempo o el volumen, que muestran picos, que representan los componentes de la muestra. Cada muestra aparece en su tiempo respectivo, llamado tiempo de retención, que tiene un área proporcional a su cantidad. [2]
La HPLC se utiliza ampliamente para fines de fabricación ( por ejemplo , durante el proceso de producción de productos farmacéuticos y biológicos), [4] [5] legales ( por ejemplo , para detectar drogas para mejorar el rendimiento en la orina), [6] de investigación ( por ejemplo , para separar los componentes de una muestra biológica compleja o de productos químicos sintéticos similares entre sí) y médicos ( por ejemplo , para detectar los niveles de vitamina D en el suero sanguíneo). [7]
La cromatografía se puede describir como un proceso de transferencia de masa que implica adsorción y/o partición . Como se mencionó, la HPLC se basa en bombas para pasar un líquido presurizado y una mezcla de muestra a través de una columna llena de adsorbente, lo que lleva a la separación de los componentes de la muestra. El componente activo de la columna, el adsorbente, es típicamente un material granular hecho de partículas sólidas ( por ejemplo , sílice , polímeros, etc.), de 1,5 a 50 μm de tamaño, en el que se pueden unir varios reactivos. [8] [9] Los componentes de la mezcla de muestra se separan entre sí debido a sus diferentes grados de interacción con las partículas adsorbentes. El líquido presurizado es típicamente una mezcla de solventes ( por ejemplo , agua, tampones , acetonitrilo y/o metanol ) y se conoce como "fase móvil". Su composición y temperatura juegan un papel importante en el proceso de separación al influir en las interacciones que tienen lugar entre los componentes de la muestra y el adsorbente. [10] Estas interacciones son de naturaleza física, como hidrófobas (dispersivas), dipolo-dipolo e iónicas, generalmente una combinación. [11] [12]
El cromatógrafo de líquidos es complejo [13] y tiene una tecnología sofisticada y delicada. Para operar correctamente el sistema, debe existir una base mínima para comprender cómo el dispositivo realiza el procesamiento de datos para evitar datos incorrectos y resultados distorsionados. [14] [15] [16]
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se distingue de la cromatografía líquida tradicional ("de baja presión") porque las presiones operativas son significativamente más altas (alrededor de 50-1400 bar), mientras que la cromatografía líquida ordinaria generalmente depende de la fuerza de la gravedad para pasar la fase móvil a través de la columna de relleno. Debido a la pequeña cantidad de muestra separada en la HPLC analítica, las dimensiones típicas de la columna son de 2,1-4,6 mm de diámetro y 30-250 mm de longitud. Además, las columnas de HPLC se fabrican con partículas adsorbentes más pequeñas (1,5-50 μm de tamaño de partícula promedio). Esto le da a la HPLC un poder de resolución superior (la capacidad de distinguir entre compuestos) al separar mezclas, lo que la convierte en una técnica cromatográfica popular. [ cita requerida ]
El esquema de un instrumento HPLC incluye típicamente depósitos de disolventes, una o más bombas, un desgasificador de disolventes , un muestreador, una columna y un detector. Los disolventes se preparan de antemano según las necesidades de la separación, pasan a través del desgasificador para eliminar los gases disueltos, se mezclan para convertirse en la fase móvil, luego fluyen a través del muestreador, que lleva la mezcla de muestra a la corriente de fase móvil, que luego la lleva a la columna. Las bombas suministran el flujo y la composición deseados de la fase móvil a través de la fase estacionaria dentro de la columna, luego directamente a una celda de flujo dentro del detector. El detector genera una señal proporcional a la cantidad de componente de muestra que emerge de la columna, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes de la muestra. El detector también marca el tiempo de emergencia, el tiempo de retención, que sirve para la identificación inicial del componente. Los detectores más avanzados, también proporcionan información adicional, específica de las características del analito, como el espectro UV-VIS o el espectro de masas , que pueden proporcionar información sobre sus características estructurales. Estos detectores son de uso común, como el detector UV/Vis, el detector de matriz de fotodiodos (PDA)/ detector de matriz de diodos y el detector de espectrometría de masas . [ cita requerida ]
Un microprocesador digital y un software de usuario controlan el instrumento HPLC y proporcionan análisis de datos. Algunos modelos de bombas mecánicas en un instrumento HPLC pueden mezclar varios solventes juntos en proporciones que cambian con el tiempo, generando un gradiente de composición en la fase móvil. La mayoría de los instrumentos HPLC también tienen un horno de columna que permite ajustar la temperatura a la que se realiza la separación. [ cita requerida ]
La mezcla de muestra que se va a separar y analizar se introduce, en un pequeño volumen discreto (normalmente microlitros), en la corriente de fase móvil que se filtra a través de la columna. Los componentes de la muestra se mueven a través de la columna, cada uno a una velocidad diferente, que es una función de interacciones físicas específicas con el adsorbente, la fase estacionaria. La velocidad de cada componente depende de su naturaleza química, de la naturaleza de la fase estacionaria (dentro de la columna) y de la composición de la fase móvil. El tiempo en el que un analito específico eluye (emerge de la columna) se denomina tiempo de retención. El tiempo de retención, medido en condiciones particulares, es una característica de identificación de un analito determinado. [ cita requerida ]
Existen muchos tipos diferentes de columnas disponibles, rellenas con adsorbentes que varían en tamaño de partícula, porosidad y química de superficie. El uso de materiales de relleno de tamaño de partícula más pequeño requiere el uso de una presión operativa más alta ("contrapresión") y, por lo general, mejora la resolución cromatográfica (el grado de separación de picos entre analitos consecutivos que emergen de la columna). Las partículas absorbentes pueden ser de naturaleza iónica, hidrófoba o polar. [ cita requerida ]
El modo más común de cromatografía líquida es la fase reversa , en la que las fases móviles utilizadas incluyen cualquier combinación miscible de agua o tampones con varios disolventes orgánicos (los más comunes son el acetonitrilo y el metanol). Algunas técnicas de HPLC utilizan fases móviles sin agua (consulte la cromatografía en fase normal a continuación). El componente acuoso de la fase móvil puede contener ácidos (como ácido fórmico, fosfórico o trifluoroacético ) o sales para ayudar en la separación de los componentes de la muestra. La composición de la fase móvil puede mantenerse constante ("modo de elución isocrática") o variar ("modo de elución en gradiente") durante el análisis cromatográfico. La elución isocrática suele ser eficaz en la separación de mezclas simples. La elución en gradiente se requiere para mezclas complejas, con interacciones variables con las fases estacionaria y móvil. Esta es la razón por la que en la elución en gradiente la composición de la fase móvil varía normalmente de baja a alta fuerza de elución. La fuerza de elución de la fase móvil se refleja en los tiempos de retención del analito, ya que la alta fuerza de elución acelera la elución (lo que da como resultado un acortamiento de los tiempos de retención). Por ejemplo, un perfil de gradiente típico en cromatografía de fase inversa podría comenzar con un 5 % de acetonitrilo (en agua o tampón acuoso) y progresar linealmente hasta el 95 % de acetonitrilo durante 5 a 25 minutos. Los períodos de composición constante de la fase móvil (meseta) también pueden ser parte de un perfil de gradiente. Por ejemplo, la composición de la fase móvil puede mantenerse constante al 5 % de acetonitrilo durante 1 a 3 minutos, seguido de un cambio lineal hasta el 95 % de acetonitrilo. [ cita requerida ]
La composición elegida de la fase móvil depende de la intensidad de las interacciones entre los distintos componentes de la muestra ("analitos") y la fase estacionaria ( por ejemplo , interacciones hidrofóbicas en la HPLC de fase inversa). Dependiendo de su afinidad por las fases estacionaria y móvil, los analitos se reparten entre las dos durante el proceso de separación que tiene lugar en la columna. Este proceso de reparto es similar al que se produce durante una extracción líquido-líquido, pero es continuo, no escalonado. [ cita requerida ]
En el ejemplo que utiliza un gradiente de agua/acetonitrilo, los componentes más hidrófobos se eluirán ( saldrán de la columna) más tarde, luego, una vez que la fase móvil se vuelve más rica en acetonitrilo ( es decir , en una fase móvil se convierte en una solución de mayor elución), su elución se acelera. [ cita requerida ]
La elección de los componentes de la fase móvil, los aditivos (como sales o ácidos) y las condiciones del gradiente dependen de la naturaleza de la columna y de los componentes de la muestra. A menudo se realiza una serie de pruebas con la muestra para encontrar el método de HPLC que proporcione la separación adecuada. [ cita requerida ]
Antes de la HPLC, los científicos utilizaban técnicas de cromatografía líquida en columna de sobremesa. Los sistemas de cromatografía líquida eran en gran medida ineficientes debido a que el caudal de los disolventes dependía de la gravedad. Las separaciones tardaban muchas horas, y a veces días, en completarse. La cromatografía de gases (GC) en ese momento era más potente que la cromatografía líquida (LC), sin embargo, era obvio que la separación en fase gaseosa y el análisis de biopolímeros de alto peso molecular muy polares era imposible. [17] La GC era ineficaz para muchas aplicaciones de biomoléculas en las ciencias de la vida y la salud, porque en su mayoría son no volátiles y térmicamente inestables a las altas temperaturas de la GC. [18] Como resultado, se plantearon la hipótesis de métodos alternativos que pronto darían lugar al desarrollo de la HPLC. [ cita requerida ]
Siguiendo el trabajo seminal de Martin y Synge en 1941, fue predicho por Calvin Giddings , [19] Josef Huber y otros en la década de 1960 que la LC podría funcionar en el modo de alta eficiencia reduciendo el diámetro de las partículas de empaquetamiento sustancialmente por debajo del nivel típico de LC (y GC) de 150 μm y usando presión para aumentar la velocidad de la fase móvil. [17] Estas predicciones fueron sometidas a una extensa experimentación y refinamiento a lo largo de los años 60 y 70 hasta estos mismos días. [20] La investigación de desarrollo temprana comenzó a mejorar las partículas LC, por ejemplo, el histórico Zipax, una partícula superficialmente porosa. [21]
En la década de 1970 se produjeron muchos avances en el hardware y la instrumentación. Los investigadores comenzaron a utilizar bombas e inyectores para realizar un diseño rudimentario de un sistema de HPLC. [22] Las bombas amplificadoras de gas eran ideales porque funcionaban a presión constante y no requerían sellos a prueba de fugas ni válvulas de retención para un flujo constante y una buena cuantificación. [18] Se lograron hitos en el hardware en Dupont IPD (División de polímeros industriales), como el uso de un dispositivo de gradiente de bajo volumen de permanencia y la sustitución del inyector de septum por una válvula de inyección de bucle. [18]
Si bien los avances en instrumentación fueron importantes, la historia de la HPLC trata principalmente de la historia y evolución de la tecnología de partículas . [18] [23] Después de la introducción de partículas de capa porosa, ha habido una tendencia constante a reducir el tamaño de partícula para mejorar la eficiencia. [18] Sin embargo, al disminuir el tamaño de partícula, surgieron nuevos problemas. Las desventajas prácticas se derivan de la caída de presión excesiva necesaria para forzar el fluido móvil a través de la columna y la dificultad de preparar un empaque uniforme de materiales extremadamente finos. [24] Cada vez que el tamaño de partícula se reduce significativamente, generalmente debe ocurrir otra ronda de desarrollo de instrumentos para manejar la presión. [20] [18]
La cromatografía de partición fue uno de los primeros tipos de cromatografía que desarrollaron los químicos y apenas se utiliza en la actualidad. [25] El principio del coeficiente de partición se ha aplicado en cromatografía en papel , cromatografía en capa fina , fase gaseosa y aplicaciones de separación líquido-líquido . El Premio Nobel de Química de 1952 lo ganaron Archer John Porter Martin y Richard Laurence Millington Synge por su desarrollo de la técnica, que se utilizó para la separación de aminoácidos . [26] La cromatografía de partición utiliza un disolvente retenido, en la superficie o dentro de los granos o fibras de una matriz de soporte sólida "inerte" como en la cromatografía en papel; o aprovecha alguna interacción coulombiana y/o donante de hidrógeno con la fase estacionaria. Las moléculas de analito se reparten entre una fase estacionaria líquida y el eluyente. Al igual que en la cromatografía de interacción hidrófila (HILIC; una subtécnica dentro de la HPLC), este método separa los analitos en función de las diferencias en su polaridad. La HILIC utiliza con mayor frecuencia una fase estacionaria polar unida y una fase móvil compuesta principalmente de acetonitrilo con agua como componente fuerte. La HPLC de partición se ha utilizado históricamente en soportes de sílice o alúmina no unidos. Cada uno funciona de manera eficaz para separar analitos por diferencias polares relativas. Las fases unidas de HILIC tienen la ventaja de separar solutos ácidos , básicos y neutros en una sola ejecución cromatográfica. [27]
Los analitos polares se difunden en una capa de agua estacionaria asociada con la fase estacionaria polar y, por lo tanto, quedan retenidos. Cuanto más fuertes sean las interacciones entre el analito polar y la fase estacionaria polar (en relación con la fase móvil), mayor será el tiempo de elución. La fuerza de la interacción depende de los grupos funcionales que forman parte de la estructura molecular del analito, y los grupos más polarizados ( por ejemplo , hidroxilo) y los grupos capaces de formar enlaces de hidrógeno inducen una mayor retención. Las interacciones coulombianas (electrostáticas) también pueden aumentar la retención. El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuirá el tiempo de retención de los analitos, mientras que los disolventes más hidrófobos tienden a aumentar los tiempos de retención. [ cita requerida ]
La cromatografía en fase normal fue uno de los primeros tipos de HPLC que desarrollaron los químicos, pero su uso ha disminuido en las últimas décadas. También conocida como HPLC en fase normal (NP-HPLC), este método separa los analitos en función de su afinidad por una superficie estacionaria polar como la sílice; por lo tanto, se basa en la capacidad del analito para participar en interacciones polares (como enlaces de hidrógeno o interacciones de tipo dipolo-dipolo ) con la superficie del sorbente. La NP-HPLC utiliza una fase móvil no polar y no acuosa ( p. ej ., cloroformo ) y funciona de manera eficaz para separar analitos fácilmente solubles en solventes no polares. El analito se asocia con la fase estacionaria polar y es retenido por ella. Las fortalezas de adsorción aumentan con el aumento de la polaridad del analito. La fortaleza de la interacción depende no solo de los grupos funcionales presentes en la estructura de la molécula del analito, sino también de factores estéricos . El efecto del impedimento estérico sobre la fuerza de interacción permite que este método resuelva (separe) isómeros estructurales . [ cita requerida ]
El uso de disolventes más polares en la fase móvil reducirá el tiempo de retención de los analitos, mientras que los disolventes más hidrófobos tienden a inducir una elución más lenta (tiempos de retención mayores). Los disolventes muy polares, como las trazas de agua en la fase móvil, tienden a adsorberse a la superficie sólida de la fase estacionaria, formando una capa estacionaria unida (agua) que se considera que desempeña un papel activo en la retención. Este comportamiento es algo peculiar de la cromatografía en fase normal porque está gobernado casi exclusivamente por un mecanismo de adsorción ( es decir , los analitos interactúan con una superficie sólida en lugar de con la capa solvatada de un ligando unido a la superficie del sorbente; consulte también la cromatografía líquida de fase inversa a continuación). La cromatografía de adsorción todavía se utiliza en cierta medida para las separaciones de isómeros estructurales tanto en formatos de cromatografía en columna como en capa fina sobre soportes de sílice o alúmina activados (secos). [ cita requerida ]
La HPLC de partición y NP perdió popularidad en la década de 1970 con el desarrollo de la HPLC de fase inversa debido a la baja reproducibilidad de los tiempos de retención debido a la presencia de una capa de agua o disolvente orgánico prótico en la superficie del medio cromatográfico de sílice o alúmina . Esta capa cambia con cualquier cambio en la composición de la fase móvil ( por ejemplo , nivel de humedad) lo que provoca tiempos de retención variables. [ cita requerida ]
Recientemente, la cromatografía de partición ha vuelto a ganar popularidad con el desarrollo de fases ligadas Hilic que demuestran una reproducibilidad mejorada y debido a una mejor comprensión del rango de utilidad de la técnica.
El uso de la cromatografía de desplazamiento es bastante limitado y se utiliza principalmente para la cromatografía preparativa. El principio básico se basa en una molécula con una alta afinidad por la matriz cromatográfica (el desplazador) que se utiliza para competir eficazmente por los sitios de unión y, por lo tanto, desplazar a todas las moléculas con menores afinidades. [28] Existen claras diferencias entre la cromatografía de desplazamiento y la de elución. En el modo de elución, las sustancias suelen emerger de una columna en picos gaussianos estrechos. Se desea una amplia separación de picos, preferiblemente hasta la línea base, para lograr la máxima purificación. La velocidad a la que cualquier componente de una mezcla viaja por la columna en el modo de elución depende de muchos factores. Pero para que dos sustancias viajen a diferentes velocidades y, por lo tanto, se resuelvan, deben existir diferencias sustanciales en alguna interacción entre las biomoléculas y la matriz cromatográfica. Los parámetros operativos se ajustan para maximizar el efecto de esta diferencia. En muchos casos, la separación de la línea base de los picos solo se puede lograr con la elución en gradiente y cargas bajas de la columna. Por lo tanto, dos desventajas de la cromatografía en modo de elución, especialmente a escala preparativa, son la complejidad operativa, debido al bombeo de disolvente en gradiente, y el bajo rendimiento, debido a las bajas cargas de la columna. La cromatografía de desplazamiento tiene ventajas sobre la cromatografía de elución en que los componentes se resuelven en zonas consecutivas de sustancias puras en lugar de "picos". Debido a que el proceso aprovecha la no linealidad de las isotermas, se puede separar una alimentación de columna más grande en una columna dada y los componentes purificados se recuperan a una concentración significativamente mayor. [ cita requerida ]
La HPLC en fase reversa (RP-HPLC) [29] es la modalidad de cromatografía más extendida. Posee una fase estacionaria apolar y una fase móvil acuosa, moderadamente polar. En los métodos en fase reversa, las sustancias se retienen en el sistema cuanto más hidrofóbicas sean. Para la retención de los materiales orgánicos, las fases estacionarias, empaquetadas en el interior de las columnas, están constituidas principalmente por gránulos porosos de gel de sílice de diversas formas, principalmente esféricos, de diferentes diámetros (1,5, 2, 3, 5, 7, 10 um), con diámetros de poro variables (60, 100, 150, 300, A), en cuya superficie se encuentran unidos químicamente diversos ligandos hidrocarbonados como C3, C4, C8, C18. También existen partículas hidrofóbicas poliméricas que sirven como fases estacionarias, cuando se necesitan soluciones a pH extremos, o sílice híbrida, polimerizada con sustancias orgánicas. Cuanto más tiempo permanezca el ligando de hidrocarburo en la fase estacionaria, más tiempo se podrán retener los componentes de la muestra. La mayoría de los métodos actuales de separación de materiales biomédicos utilizan columnas de tipo C-18, a veces denominadas por nombres comerciales como ODS (octadecilsilano) o RP-18 (fase reversa 18).
Las fases estacionarias RP más comunes se basan en un soporte de sílice, cuya superficie se modifica mediante la unión de RMe2SiCl , donde R es un grupo alquilo de cadena lineal como C18H37 o C8H17 .
Con estas fases estacionarias, el tiempo de retención es más largo para las moléculas lipofílicas, mientras que las moléculas polares se eluyen más fácilmente (emergen temprano en el análisis). Un cromatógrafo puede aumentar los tiempos de retención añadiendo más agua a la fase móvil, haciendo así que las interacciones del analito hidrófobo con la fase estacionaria hidrófoba sean relativamente más fuertes. De manera similar, un investigador puede disminuir el tiempo de retención añadiendo más disolvente orgánico a la fase móvil. La RP-HPLC se utiliza tan comúnmente entre los biólogos y los usuarios de las ciencias de la vida, por lo que a menudo se la denomina incorrectamente simplemente "HPLC" sin más especificaciones. La industria farmacéutica también emplea regularmente la RP-HPLC para calificar los medicamentos antes de su lanzamiento. [ cita requerida ]
La RP-HPLC funciona según el principio de interacciones hidrofóbicas, que se origina a partir de la alta simetría en la estructura dipolar del agua y desempeña el papel más importante en todos los procesos de las ciencias de la vida. La RP-HPLC permite la medición de estas fuerzas interactivas. La unión del analito a la fase estacionaria es proporcional al área de superficie de contacto alrededor del segmento no polar de la molécula del analito al asociarse con el ligando en la fase estacionaria. Este efecto solvofóbico está dominado por la fuerza del agua para la "reducción de la cavidad" alrededor del analito y la cadena C 18 frente al complejo de ambos. La energía liberada en este proceso es proporcional a la tensión superficial del eluyente (agua: 7,3 × 10 −6 J /cm 2 , metanol: 2,2 × 10 −6 J/cm 2 ) y a la superficie hidrofóbica del analito y el ligando respectivamente. La retención se puede reducir añadiendo un disolvente menos polar (metanol, acetonitrilo ) a la fase móvil para reducir la tensión superficial del agua. La elución por gradiente utiliza este efecto reduciendo automáticamente la polaridad y la tensión superficial de la fase móvil acuosa durante el transcurso del análisis.
Las propiedades estructurales de la molécula de analito pueden desempeñar un papel importante en sus características de retención. En teoría, un analito con una mayor área superficial hidrofóbica (C–H, C–C y enlaces atómicos generalmente no polares, como SS y otros) puede retenerse durante más tiempo ya que no interactúa con la estructura del agua. Por otro lado, los analitos con una mayor área superficial polar (como resultado de la presencia de grupos polares, como -OH, -NH 2 , COO − o -NH 3 + en su estructura) se retienen menos, ya que se integran mejor en el agua. Las interacciones con la fase estacionaria también pueden verse afectadas por efectos estéricos o efectos de exclusión, por lo que un componente de una molécula muy grande puede tener solo un acceso restringido a los poros de la fase estacionaria, donde tienen lugar las interacciones con los ligandos de superficie (cadenas alquílicas). Este impedimento de la superficie normalmente da como resultado una menor retención.
El tiempo de retención aumenta cuanto mayor es la superficie hidrofóbica (no polar) de las moléculas. Por ejemplo, los compuestos de cadena ramificada pueden eluir más rápidamente que sus isómeros lineales correspondientes porque su superficie total es menor. De manera similar, los compuestos orgánicos con enlaces C-C simples con frecuencia eluyen más tarde que aquellos con un enlace C=C o incluso triple, ya que el enlace doble o triple hace que la molécula sea más compacta que un enlace C-C simple.
Otro factor importante es el pH de la fase móvil, ya que puede cambiar el carácter hidrofóbico del analito ionizable. Por esta razón, la mayoría de los métodos utilizan un agente tampón , como el fosfato de sodio , para controlar el pH. Los tampones sirven para múltiples propósitos: control del pH que afecta el estado de ionización de los analitos ionizables, afectan la carga sobre la superficie de sílice ionizable de la fase estacionaria entre los linandos de la fase enlazada y, en algunos casos, incluso actúan como agentes de apareamiento iónico para neutralizar la carga del analito. El formato de amonio se agrega comúnmente en la espectrometría de masas para mejorar la detección de ciertos analitos mediante la formación de aductos de amonio-analito . A menudo se agrega un ácido orgánico volátil como el ácido acético , o más comúnmente el ácido fórmico , a la fase móvil si se utiliza la espectrometría de masas para analizar los efluentes de la columna.
El ácido trifluoroacético (TFA) como aditivo para la fase móvil se utiliza ampliamente para mezclas complejas de muestras biomédicas, principalmente péptidos y proteínas, utilizando principalmente detectores basados en UV. Rara vez se utilizan en métodos de espectrometría de masas, debido a los residuos que puede dejar en el detector y el sistema de suministro de disolvente, que interfieren con el análisis y la detección. Sin embargo, el TFA puede ser muy eficaz para mejorar la retención de analitos como los ácidos carboxílicos , en aplicaciones que utilizan otros detectores como UV-VIS, ya que es un ácido orgánico bastante fuerte. Los efectos de los ácidos y los tampones varían según la aplicación, pero generalmente mejoran la resolución cromatográfica cuando se trata de componentes ionizables.
Las columnas de fase reversa son bastante difíciles de dañar en comparación con las columnas de sílice normales, gracias al efecto protector de los ligandos hidrófobos unidos; sin embargo, la mayoría de las columnas de fase reversa consisten en partículas de sílice derivadas de alquilo y son propensas a la hidrólisis de la sílice en condiciones de pH extremas en la fase móvil. La mayoría de los tipos de columnas de RP no deben usarse con bases acuosas, ya que estas hidrolizarán la partícula de sílice subyacente y la disolverán. Existen marcas seleccionadas de partículas de sílice híbridas o reforzadas de columnas de RP que se pueden usar en condiciones de pH extremas. Tampoco se recomienda el uso de condiciones ácidas extremas, ya que también podrían hidrolizar y corroer las paredes internas de las partes metálicas del equipo de HPLC.
Como regla general, en la mayoría de los casos, las columnas de RP-HPLC deben enjuagarse con un disolvente limpio después de su uso para eliminar los ácidos o tampones residuales, y almacenarse en una composición adecuada de disolvente. Algunas aplicaciones biomédicas requieren un entorno no metálico para una separación óptima. Para estos casos tan sensibles, existe una prueba para el contenido de metal de una columna que consiste en inyectar una muestra que es una mezcla de 2,2'- y 4,4' - bipiridina . Debido a que la 2,2'-bipiridina puede formar quelatos con el metal, la forma del pico de la 2,2'-bipiridina se distorsionará (tendrá cola) cuando haya iones metálicos presentes en la superficie de la sílice . [ cita requerida ] ..
La cromatografía de exclusión por tamaño ( SEC ) [30] separa las moléculas de polímeros y biomoléculas en función de las diferencias en su tamaño molecular (en realidad, por el radio de Stokes de una partícula ). El proceso de separación se basa en la capacidad de las moléculas de muestra para permear a través de los poros de las esferas de gel, empaquetadas dentro de la columna, y depende del tamaño relativo de las moléculas de analito y del tamaño de poro respectivo del absorbente. El proceso también se basa en la ausencia de interacciones con la superficie del material de empaque.
Generalmente se denominan dos tipos de SEC:
El principio de separación en SEC se basa en la penetración total o parcial de las sustancias de alto peso molecular de la muestra en las partículas porosas de la fase estacionaria durante su transporte a través de la columna. El eluyente de la fase móvil se selecciona de tal manera que impida totalmente las interacciones con la superficie de la fase estacionaria. En estas condiciones, cuanto menor sea el tamaño de la molécula, más capaz es de penetrar dentro del espacio poroso y el movimiento a través de la columna toma más tiempo. Por otro lado, cuanto mayor sea el tamaño molecular, mayor será la probabilidad de que la molécula no penetre completamente en los poros de la fase estacionaria, e incluso se desplace alrededor de ellos, por lo que se eluirá antes. Las moléculas se separan en orden decreciente de peso molecular, con las moléculas más grandes eluyendo de la columna primero y las moléculas más pequeñas eluyendo después. Las moléculas más grandes que el tamaño de los poros no entran en los poros en absoluto, y eluyen juntas como el primer pico en el cromatograma; esto se llama volumen de exclusión total, que define el límite de exclusión para una columna en particular. Las moléculas pequeñas penetrarán completamente a través de los poros de las partículas de la fase estacionaria y se eluirá en último lugar, marcando el final del cromatograma y pueden aparecer como un marcador de penetración total.
En las ciencias biomédicas, se considera generalmente como una cromatografía de baja resolución y, por lo tanto, a menudo se reserva para el paso final de "pulido" de la purificación. También es útil para determinar la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. La SEC se utiliza principalmente para el análisis de moléculas grandes, como proteínas o polímeros. La SEC también funciona de forma preparativa atrapando las moléculas más pequeñas en los poros de una partícula. Las moléculas más grandes simplemente pasan por los poros, ya que son demasiado grandes para entrar en ellos. Por lo tanto, las moléculas más grandes fluyen a través de la columna más rápido que las moléculas más pequeñas: es decir, cuanto más pequeña sea la molécula, mayor será el tiempo de retención.
Esta técnica se utiliza ampliamente para la determinación del peso molecular de los polisacáridos. La SEC es la técnica oficial (sugerida por la farmacopea europea) para la comparación del peso molecular de diferentes heparinas de bajo peso molecular disponibles comercialmente . [31]
La cromatografía de intercambio iónico ( IEC ) o cromatografía iónica ( IC ) [32] es una técnica analítica para la separación y determinación de solutos iónicos en muestras acuosas de origen ambiental e industrial como la industria metalúrgica, aguas residuales industriales, en sistemas biológicos, muestras farmacéuticas, alimentos, etc. La retención se basa en la atracción entre los iones de soluto y los sitios cargados unidos a la fase estacionaria. Los iones de soluto cargados igual que los iones de la columna son repelidos y eluidos sin retención, mientras que los iones de soluto cargados de forma opuesta a los sitios cargados de la columna son retenidos en ella. Los iones de soluto que son retenidos en la columna pueden eluirse de ella cambiando la composición de la fase móvil, como aumentando su concentración de sal y pH o aumentando la temperatura de la columna, etc.
Los tipos de intercambiadores de iones incluyen resinas de poliestireno , intercambiadores de iones de celulosa y dextrano (geles) y vidrio de poro controlado o gel de sílice poroso . Las resinas de poliestireno permiten la reticulación, lo que aumenta la estabilidad de la cadena. Una mayor reticulación reduce la desviación, lo que aumenta el tiempo de equilibrio y, en última instancia, mejora la selectividad. Los intercambiadores de iones de celulosa y dextrano poseen tamaños de poro más grandes y densidades de carga bajas, lo que los hace adecuados para la separación de proteínas.
En general, los intercambiadores de iones favorecen la unión de iones de mayor carga y menor radio.
Un aumento en la concentración de contraiones (con respecto a los grupos funcionales en las resinas) reduce el tiempo de retención, ya que crea una fuerte competencia con los iones del soluto. Una disminución del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, mientras que un aumento del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio aniónico. Al reducir el pH del solvente en una columna de intercambio catiónico, por ejemplo, hay más iones de hidrógeno disponibles para competir por posiciones en la fase estacionaria aniónica, eluyendo así los cationes débilmente unidos.
Esta forma de cromatografía se utiliza ampliamente en las siguientes aplicaciones: purificación de agua, preconcentración de componentes traza, cromatografía de intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio iónico de proteínas, cromatografía de intercambio aniónico de alto pH de carbohidratos y oligosacáridos, y otras.
La cromatografía de afinidad de alto rendimiento (HPAC) [33] funciona haciendo pasar una solución de muestra a través de una columna llena de una fase estacionaria que contiene un ligando biológicamente activo inmovilizado. El ligando es, de hecho, un sustrato que tiene una afinidad de unión específica por la molécula objetivo en la solución de muestra. La molécula objetivo se une al ligando, mientras que las otras moléculas en la solución de muestra pasan a través de la columna, teniendo poca o ninguna retención. Luego, la molécula objetivo se eluye de la columna utilizando un tampón de elución adecuado.
Este proceso cromatográfico se basa en la capacidad de las sustancias activas enlazadas para formar complejos estables, específicos y reversibles gracias a su reconocimiento biológico de ciertos componentes específicos de la muestra. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares comunes como la interacción de Van der Waals , la interacción electrostática, la interacción dipolo-dipolo, la interacción hidrofóbica y el enlace de hidrógeno. Un enlace bioespecífico eficiente se forma mediante una acción simultánea y concertada de varias de estas fuerzas en los sitios de unión complementarios.
La cromatografía en fase normal acuosa ( ANP ) también se denomina cromatografía líquida de interacción hidrófila ( HILIC ). [34] Esta es una técnica cromatográfica que abarca la región de fase móvil entre la cromatografía en fase inversa (RP) y la cromatografía en fase normal orgánica (ONP). La HILIC se utiliza para lograr una selectividad única para compuestos hidrófilos, [35] mostrando un orden de elución en fase normal, utilizando "disolventes de fase inversa", es decir, disolventes relativamente polares en su mayoría no acuosos en la fase móvil. [34] Muchas moléculas biológicas, especialmente las que se encuentran en fluidos biológicos, son compuestos polares pequeños que no se retienen bien mediante HPLC de fase inversa. Esto ha hecho que la LC de interacción hidrófila (HILIC) sea una alternativa atractiva y un enfoque útil para el análisis de moléculas polares. Además, debido a que la HILIC se utiliza rutinariamente con mezclas acuosas tradicionales con disolventes orgánicos polares como ACN y metanol, se puede acoplar fácilmente a MS. [35]
Una separación en la que la composición de la fase móvil permanece constante durante todo el procedimiento se denomina isocrática (que significa composición constante ). El término fue acuñado por Csaba Horvath , uno de los pioneros de la HPLC. [36] [37]
La composición de la fase móvil no tiene por qué permanecer constante. Una separación en la que la composición de la fase móvil cambia durante el proceso de separación se describe como una elución en gradiente . [38] [39] Por ejemplo, un gradiente puede comenzar con un 10 % de metanol en agua y terminar con un 90 % de metanol en agua después de 20 minutos. Los dos componentes de la fase móvil se denominan típicamente "A" y "B"; A es el disolvente "débil" que permite que el soluto eluya solo lentamente, mientras que B es el disolvente "fuerte" que eluye rápidamente los solutos de la columna. En la cromatografía de fase inversa , el disolvente A suele ser agua o un tampón acuoso, mientras que B es un disolvente orgánico miscible con agua, como acetonitrilo , metanol, THF o isopropanol .
En la elución isocrática, el ancho de pico aumenta con el tiempo de retención de manera lineal según la ecuación para N, el número de platos teóricos. Esto puede ser una desventaja importante cuando se analiza una muestra que contiene analitos con un amplio rango de factores de retención. Al usar una fase móvil más débil, el tiempo de ejecución se alarga y da como resultado picos de elución lenta que son anchos, lo que lleva a una sensibilidad reducida. Una fase móvil más fuerte mejoraría los problemas de tiempo de ejecución y ensanchamiento de picos posteriores, pero da como resultado una separación de picos reducida, especialmente para analitos de elución rápida que pueden tener tiempo insuficiente para resolverse por completo. Este problema se aborda mediante el cambio de la composición de la fase móvil de la elución en gradiente.
Al comenzar con una fase móvil más débil y fortalecerla durante el tiempo de ejecución, la elución en gradiente disminuye la retención de los componentes que eluyen más tarde, de modo que eluyen más rápido, lo que da picos más estrechos (y más altos) para la mayoría de los componentes, al tiempo que permite la separación adecuada de los componentes que eluyen antes. Esto también mejora la forma del pico para los picos con cola, ya que la concentración creciente del eluyente orgánico empuja la parte de cola de un pico hacia adelante. Esto también aumenta la altura del pico (el pico se ve "más nítido"), lo que es importante en el análisis de trazas. El programa de gradiente puede incluir aumentos repentinos "en pasos" en el porcentaje del componente orgánico, o diferentes pendientes en diferentes momentos, todo de acuerdo con el deseo de una separación óptima en un tiempo mínimo.
En la elución isocrática, el orden de retención no cambia si cambian las dimensiones de la columna (longitud y diámetro interno), es decir, los picos eluyen en el mismo orden. Sin embargo, en la elución en gradiente, el orden de elución puede cambiar a medida que cambian las dimensiones o el caudal, si no se reducen o aumentan de escala según el cambio [40].
La fuerza impulsora de la cromatografía de fase inversa se origina en el orden superior de la estructura del agua. La función del componente orgánico de la fase móvil es reducir este orden superior y, por lo tanto, reducir la capacidad retardante del componente acuoso.
La teoría de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es, en esencia, la misma que la teoría de la cromatografía general. [41] Esta teoría se ha utilizado como base para las pruebas de idoneidad del sistema , como se puede ver en la Farmacopea de la USP, [42] que son un conjunto de criterios cuantitativos que prueban la idoneidad del sistema HPLC para el análisis requerido en cualquier paso del mismo.
Esta relación también se representa como un factor normalizado sin unidades conocido como factor de retención o parámetro de retención, que es la medida experimental de la relación de capacidad, como se muestra también en la Figura de Criterios de Desempeño. t R es el tiempo de retención del componente específico y t 0 es el tiempo que tarda una sustancia no retenida en eluirse a través del sistema sin ninguna retención, por lo que se denomina Tiempo de Vacío.
La relación entre los factores de retención, k', de cada dos picos adyacentes en el cromatograma se utiliza en la evaluación del grado de separación entre ellos, y se denomina factor de selectividad , α, como se muestra en el gráfico de Criterios de Desempeño.
El recuento de placas N como criterio para la eficiencia del sistema se desarrolló para condiciones isocráticas, es decir, una composición de fase móvil constante durante la ejecución. En condiciones de gradiente, donde la fase móvil cambia con el tiempo durante la ejecución cromatográfica, es más apropiado utilizar el parámetro capacidad de pico P c como una medida para la eficiencia del sistema. [43] La definición de capacidad de pico en cromatografía es el número de picos que se pueden separar dentro de una ventana de retención para un factor de resolución predefinido específico, generalmente ~1. También podría visualizarse como el tiempo de ejecución medido en número de anchos promedio de picos. La ecuación se muestra en la Figura de los criterios de rendimiento. En esta ecuación, tg es el tiempo de gradiente y w(ave) es el ancho promedio de los picos en la base.
Los parámetros se derivan en gran medida de dos conjuntos de teorías cromatográficas: la teoría de placas (como parte de la cromatografía de partición ) y la teoría de velocidad de la cromatografía/ ecuación de Van Deemter . Por supuesto, se pueden poner en práctica mediante el análisis de cromatogramas de HPLC, aunque la teoría de velocidad se considera la teoría más precisa.
Son análogos al cálculo del factor de retención para una separación por cromatografía en papel , pero describen qué tan bien la HPLC separa una mezcla en dos o más componentes que se detectan como picos (bandas) en un cromatograma. Los parámetros de la HPLC son: el factor de eficiencia ( N ), el factor de retención (kappa primo) y el factor de separación (alfa). Juntos, los factores son variables en una ecuación de resolución, que describe qué tan bien se separaron o superpusieron entre sí los picos de dos componentes. Estos parámetros se utilizan principalmente solo para describir las separaciones de fase reversa y fase normal de HPLC, ya que esas separaciones tienden a ser más sutiles que otros modos de HPLC ( por ejemplo , intercambio iónico y exclusión por tamaño).
El volumen vacío es la cantidad de espacio en una columna que está ocupado por el solvente. Es el espacio dentro de la columna que está fuera del material de relleno interno de la columna. El volumen vacío se mide en un cromatograma como el primer pico de componente detectado, que generalmente es el solvente que estaba presente en la mezcla de muestra; idealmente, el solvente de muestra fluye a través de la columna sin interactuar con ella, pero aún es detectable como distinto del solvente de HPLC. El volumen vacío se utiliza como un factor de corrección.
El factor de eficiencia ( N ) mide prácticamente qué tan nítidos son los picos de los componentes en el cromatograma, como la relación entre el área del pico del componente ("tiempo de retención") y el ancho de los picos en su punto más ancho (en la línea base). Los picos altos, nítidos y relativamente estrechos indican que el método de separación eliminó de manera eficiente un componente de una mezcla; alta eficiencia. La eficiencia depende en gran medida de la columna de HPLC y del método de HPLC utilizado. El factor de eficiencia es sinónimo de número de platos y "número de platos teóricos".
El factor de retención ( kappa prime ) mide el tiempo que un componente de la mezcla permanece adherido a la columna, medido por el área bajo la curva de su pico en un cromatograma (ya que los cromatogramas de HPLC son una función del tiempo). Cada pico del cromatograma tendrá su propio factor de retención ( por ejemplo , kappa 1 para el factor de retención del primer pico). Este factor puede corregirse por el volumen vacío de la columna.
El factor de separación ( alfa ) es una comparación relativa de qué tan bien se separaron dos componentes vecinos de la mezcla ( es decir , dos bandas vecinas en un cromatograma). Este factor se define en términos de una relación de los factores de retención de un par de picos vecinos del cromatograma, y también puede corregirse por el volumen vacío de la columna. Cuanto mayor sea el valor del factor de separación por encima de 1,0, mejor será la separación, hasta aproximadamente 2,0 más allá del cual probablemente no se necesite un método HPLC para la separación. Las ecuaciones de resolución relacionan los tres factores de tal manera que la alta eficiencia y los factores de separación mejoran la resolución de los picos de los componentes en una separación HPLC.
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El diámetro interno (DI) de una columna de HPLC es un parámetro importante. [44] Puede influir en la respuesta de detección cuando se reduce debido a la difusión lateral reducida de la banda de soluto. También puede afectar la selectividad de la separación, cuando el caudal y los volúmenes de inyección no se reducen o aumentan proporcionalmente al diámetro más pequeño o más grande utilizado, tanto en el modo isocrático como en el de gradiente. [45] Determina la cantidad de analito que se puede cargar en la columna. Las columnas de mayor diámetro se ven generalmente en aplicaciones preparativas, como la purificación de un producto farmacéutico para su uso posterior. [46] Las columnas de DI bajo han mejorado la sensibilidad y el consumo de disolventes en la reciente cromatografía líquida de ultraalta resolución (UHPLC). [47]
Se utilizan columnas de diámetro interior más grande (más de 10 mm) para purificar cantidades utilizables de material debido a su gran capacidad de carga.
Las columnas de escala analítica (4,6 mm) han sido el tipo de columna más común, aunque las columnas más estrechas [47] están ganando popularidad rápidamente. Se utilizan en el análisis cuantitativo tradicional de muestras y, a menudo, utilizan un detector de absorbancia UV-Vis .
Las columnas de diámetro estrecho (1–2 mm) se utilizan para aplicaciones en las que se desea una mayor sensibilidad, ya sea con detectores UV-vis especiales, detección de fluorescencia o con otros métodos de detección como cromatografía líquida-espectrometría de masas.
Las columnas capilares (de menos de 0,3 mm) se utilizan casi exclusivamente con medios de detección alternativos, como la espectrometría de masas . Suelen estar hechas de capilares de sílice fundida , en lugar de los tubos de acero inoxidable que utilizan las columnas más grandes.
La mayoría de los métodos tradicionales de HPLC se realizan con la fase estacionaria adherida al exterior de pequeñas partículas esféricas de sílice (perlas muy pequeñas). Estas partículas vienen en una variedad de tamaños, siendo las perlas de 5 μm las más comunes. Las partículas más pequeñas generalmente proporcionan más área de superficie y mejores separaciones, pero la presión requerida para una velocidad lineal óptima aumenta por el inverso del diámetro de la partícula al cuadrado. [48] [49] [50]
Según las ecuaciones [51] de la velocidad de la columna, la eficiencia y la contrapresión , al reducir el diámetro de las partículas a la mitad y mantener el tamaño de la columna igual, se duplicará la velocidad y la eficiencia de la columna; pero se cuadruplicará la contrapresión. Y las partículas pequeñas de HPLC también pueden disminuir el ensanchamiento de ancho. [52] Las partículas más grandes se utilizan en HPLC preparativa (diámetros de columna de 5 cm hasta >30 cm) y para aplicaciones que no son de HPLC, como la extracción en fase sólida .
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor área de superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor área de superficie, mientras que un tamaño de poro mayor tiene una mejor cinética, especialmente para analitos más grandes. Por ejemplo, una proteína que es apenas un poco más pequeña que un poro podría entrar en el poro, pero no salir fácilmente una vez dentro.
Las bombas varían en capacidad de presión, pero su rendimiento se mide en su capacidad para producir un caudal volumétrico consistente y reproducible . La presión puede alcanzar hasta 60 MPa (6000 lbf/in 2 ), o alrededor de 600 atmósferas. Los sistemas HPLC modernos se han mejorado para trabajar a presiones mucho más altas y, por lo tanto, pueden utilizar tamaños de partículas mucho más pequeños en las columnas (<2 μm). Estos sistemas de "cromatografía líquida de ultra alto rendimiento" o UHPLC, que también podrían conocerse como sistemas de cromatografía de ultra alta presión, [53] pueden trabajar hasta a 120 MPa (17,405 lbf/in 2 ), o alrededor de 1200 atmósferas. [54] El término "UPLC" [55] es una marca registrada de Waters Corporation , pero a veces se utiliza para referirse a la técnica más general de UHPLC.
Los detectores de HPLC se dividen en dos categorías principales: universales o selectivos. Los detectores universales suelen medir una propiedad a granel ( p. ej. , índice de refracción ) midiendo una diferencia de una propiedad física entre la fase móvil y la fase móvil con soluto, mientras que los detectores selectivos miden una propiedad del soluto ( p. ej. , absorbancia UV-Vis ) simplemente respondiendo a la propiedad física o química del soluto. [56] La HPLC utiliza más comúnmente un detector de absorbancia UV-Vis ; sin embargo, se puede utilizar una amplia gama de otros detectores de cromatografía . Un detector universal que complementa la detección de absorbancia UV-Vis es el detector de aerosol cargado (CAD). Un tipo de detector comúnmente utilizado incluye detectores de índice de refracción, que proporcionan lecturas midiendo los cambios en el índice de refracción del eluyente a medida que se mueve a través de la celda de flujo. En ciertos casos, es posible utilizar múltiples detectores, por ejemplo, LCMS normalmente combina UV-Vis con un espectrómetro de masas.
Cuando se utiliza con un detector electroquímico (ECD), el HPLC-ECD detecta selectivamente neurotransmisores como: norepinefrina , dopamina , serotonina , glutamato , GABA, acetilcolina y otros en aplicaciones de investigación de análisis neuroquímico. [57] El HPLC-ECD detecta neurotransmisores en el rango femtomolar . Otros métodos para detectar neurotransmisores incluyen cromatografía líquida-espectrometría de masas, ELISA o radioinmunoensayos.
Se pueden inyectar automáticamente grandes cantidades de muestras en un sistema HPLC mediante el uso de muestreadores automáticos de HPLC. Además, los muestreadores automáticos de HPLC tienen un volumen y una técnica de inyección que son exactamente los mismos para cada inyección, por lo que proporcionan un alto grado de precisión en el volumen de inyección. Es posible permitir la agitación de la muestra dentro de la cámara de muestreo, lo que promueve la homogeneidad. [58]
La HPLC tiene muchas aplicaciones tanto en el laboratorio como en la ciencia clínica. Es una técnica común utilizada en el desarrollo farmacéutico, ya que es una forma confiable de obtener y garantizar la pureza del producto. [59] Si bien la HPLC puede producir productos de calidad extremadamente alta (puros), no siempre es el método principal utilizado en la producción de materiales farmacéuticos a granel. [60] Según la farmacopea europea, la HPLC se utiliza en solo el 15,5 % de las síntesis. [61] Sin embargo, desempeña un papel en el 44 % de las síntesis en la farmacopea de los Estados Unidos. [62] Esto posiblemente se deba a diferencias en las limitaciones monetarias y de tiempo, ya que la HPLC a gran escala puede ser una técnica costosa. Un aumento en la especificidad, precisión y exactitud que ocurre con la HPLC lamentablemente corresponde a un aumento en el costo.
Esta técnica también se utiliza para la detección de drogas ilícitas en varias muestras. [63] El método más común de detección de drogas ha sido un inmunoensayo . [64] Este método es mucho más conveniente. Sin embargo, la conveniencia viene a costa de la especificidad y la cobertura de una amplia gama de drogas, por lo tanto, se ha utilizado HPLC como un método alternativo. Como HPLC es un método para determinar (y posiblemente aumentar) la pureza, el uso de HPLC solo para evaluar las concentraciones de drogas fue algo insuficiente. Por lo tanto, la HPLC en este contexto a menudo se realiza junto con la espectrometría de masas . [65] El uso de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) en lugar de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) evita la necesidad de derivatizar con agentes acetilantes o alquilantes, lo que puede ser un paso adicional engorroso. [66] La LC-MS se ha utilizado para detectar una variedad de agentes como agentes dopantes, metabolitos de drogas, conjugados de glucurónido, anfetaminas, opioides, cocaína, BZD, ketamina, LSD, cannabis y pesticidas. [67] [68] La realización de HPLC junto con la espectrometría de masas reduce la necesidad absoluta de estandarizar las ejecuciones experimentales de HPLC.
Se pueden realizar ensayos similares con fines de investigación, detectando concentraciones de posibles candidatos clínicos, como fármacos antifúngicos y antiasmáticos. [69] Obviamente, esta técnica también es útil para observar múltiples especies en muestras recolectadas, pero requiere el uso de soluciones estándar cuando se busca información sobre la identidad de las especies. Se utiliza como método para confirmar los resultados de las reacciones de síntesis, ya que la pureza es esencial en este tipo de investigación. Sin embargo, la espectrometría de masas sigue siendo la forma más confiable de identificar especies.
El uso médico de HPLC generalmente utiliza un espectrómetro de masas (MS) como detector, por lo que la técnica se llama LC-MS [70] o LC-MS/MS para MS en tándem, donde dos tipos de MS se operan secuencialmente. [71] Cuando el instrumento HPLC está conectado a más de un detector, se llama sistema LC con guión. [ cita requerida ] Las aplicaciones farmacéuticas [72] son los principales usuarios de HPLC, LC-MS y LC-MS/MS. [73] Esto incluye el desarrollo de fármacos [74] y la farmacología, que es el estudio científico de los efectos de los fármacos y los productos químicos en los organismos vivos, [75] la medicina personalizada, [76] la salud pública [77] [78] y los diagnósticos. [79] Si bien la orina es el medio más común para analizar las concentraciones de fármacos, el suero sanguíneo es la muestra recolectada para la mayoría de los análisis médicos con HPLC. [80] Uno de los roles más importantes de LC-MS y LC-MS/MS en el laboratorio clínico es el Tamizaje Neonatal (NBS) para trastornos metabólicos [81] y diagnósticos de seguimiento. [82] [83] Las muestras de los bebés vienen en forma de gota de sangre seca (DBS), [84] que es fácil de preparar y transportar, lo que permite diagnósticos seguros y accesibles, tanto a nivel local como global.
Se han probado otros métodos de detección de moléculas que son útiles para estudios clínicos frente a la HPLC, a saber, los inmunoensayos. En un ejemplo de esto, se compararon los ensayos de unión a proteínas competitivas (CPBA) y la HPLC para determinar la sensibilidad en la detección de vitamina D. Útil para diagnosticar deficiencias de vitamina D en niños, se encontró que la sensibilidad y la especificidad de este CPBA alcanzaron solo el 40% y el 60%, respectivamente, de la capacidad de la HPLC. [85] Si bien es una herramienta costosa, la precisión de la HPLC es casi incomparable.
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