La cromatografía iónica (o cromatografía de intercambio iónico ) es una forma de cromatografía que separa iones y moléculas polares ionizables en función de su afinidad con el intercambiador de iones . [1] Funciona en casi cualquier tipo de molécula cargada , incluidos aniones inorgánicos pequeños , [2] proteínas grandes , [3] nucleótidos pequeños , [4] y aminoácidos . Sin embargo, la cromatografía iónica debe realizarse en condiciones que estén a una unidad de pH del punto isoeléctrico de una proteína. [5]
Los dos tipos de cromatografía iónica son la de intercambio aniónico y la de intercambio catiónico. La cromatografía de intercambio catiónico se utiliza cuando la molécula de interés tiene carga positiva. La molécula tiene carga positiva porque el pH para la cromatografía es menor que el pI (también conocido como pH(I)). [6] En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria tiene carga negativa y las moléculas con carga positiva se cargan para ser atraídas hacia ella. La cromatografía de intercambio aniónico es cuando la fase estacionaria tiene carga positiva y las moléculas con carga negativa (lo que significa que el pH para la cromatografía es mayor que el pI) se cargan para ser atraídas hacia ella. [7] A menudo se utiliza en la purificación de proteínas, el análisis de agua, [8] [9] y el control de calidad. Las moléculas solubles en agua y cargadas, como las proteínas, los aminoácidos y los péptidos, se unen a fracciones que tienen carga opuesta formando enlaces iónicos con la fase estacionaria insoluble. [10] La fase estacionaria equilibrada consiste en un grupo funcional ionizable donde las moléculas objetivo de una mezcla que se va a separar y cuantificar pueden unirse mientras pasan a través de la columna: se utiliza una fase estacionaria catiónica para separar aniones y una fase estacionaria aniónica para separar cationes. La cromatografía de intercambio catiónico se utiliza cuando las moléculas deseadas para separar son cationes y la cromatografía de intercambio aniónico se utiliza para separar aniones. [11] Las moléculas unidas se pueden eluir y recolectar utilizando un eluyente que contiene aniones y cationes haciendo pasar una mayor concentración de iones a través de la columna o cambiando el pH de la columna.
Una de las principales ventajas del uso de la cromatografía iónica es que solo interviene una interacción en la separación, a diferencia de otras técnicas de separación; por lo tanto, la cromatografía iónica puede tener una mayor tolerancia a la matriz. Otra ventaja del intercambio iónico es la previsibilidad de los patrones de elución (basados en la presencia del grupo ionizable). [12] Por ejemplo, cuando se utiliza la cromatografía de intercambio catiónico, ciertos cationes se eluirán primero y otros después. Siempre se mantiene un equilibrio de carga local. Sin embargo, también existen desventajas involucradas cuando se realiza la cromatografía de intercambio iónico, como la evolución constante de la técnica que conduce a la inconsistencia de una columna a otra. [13] Una limitación importante de esta técnica de purificación es que está limitada al grupo ionizable. [6]
La cromatografía iónica ha avanzado gracias a la acumulación de conocimientos a lo largo de muchos años. A partir de 1947, Spedding y Powell utilizaron la cromatografía de intercambio iónico por desplazamiento para la separación de tierras raras. Además, demostraron la separación por intercambio iónico de los isótopos 14N y 15N en amoníaco. A principios de la década de 1950, Kraus y Nelson demostraron el uso de muchos métodos analíticos para iones metálicos que dependen de la separación de sus complejos de cloruro, fluoruro, nitrato o sulfato mediante cromatografía de aniones. La detección automática en línea se introdujo progresivamente entre 1960 y 1980, así como nuevos métodos cromatográficos para la separación de iones metálicos. Un método innovador de Small, Stevens y Bauman en Dow Chemical Co. dio lugar a la creación de la cromatografía iónica moderna. Los aniones y cationes ahora se podían separar de manera eficiente mediante un sistema de detección de conductividad suprimida. En 1979, Gjerde et al. introdujeron un método para la cromatografía de aniones con detección de conductividad no suprimida. En 1980, se introdujo un método similar para la cromatografía de cationes. [14]
Como resultado, comenzó un período de competencia extrema dentro del mercado de CI, con partidarios tanto de la detección de conductividad suprimida como de la no suprimida. Esta competencia condujo al rápido crecimiento de nuevas formas y a la rápida evolución de los CI. [15] Un desafío que se debe superar en el desarrollo futuro de los CI es la preparación de columnas de intercambio iónico monolíticas altamente eficientes y superar este desafío sería de gran importancia para el desarrollo de los CI. [16]
El auge de la cromatografía de intercambio iónico comenzó principalmente entre 1935 y 1950 durante la Segunda Guerra Mundial y fue a través del " proyecto Manhattan " que las aplicaciones y la CI se extendieron significativamente. La cromatografía iónica fue introducida originalmente por dos investigadores ingleses, el agricultor Sir Thompson y el químico JT Way. Los trabajos de Thompson y Way involucraron la acción de sales fertilizantes solubles en agua, sulfato de amonio y cloruro de potasio. Estas sales no podían extraerse fácilmente del suelo debido a la lluvia. Realizaron métodos iónicos para tratar arcillas con las sales, lo que resultó en la extracción de amoníaco además de la liberación de calcio. [17] [ ¿ fuente poco confiable? ] Fue en los años cincuenta y sesenta que se desarrollaron modelos teóricos para la CI para una mayor comprensión y no fue hasta los años setenta que se utilizaron detectores continuos, allanando el camino para el desarrollo de la cromatografía de baja presión a la de alto rendimiento. No fue hasta 1975 que se estableció el nombre de “cromatografía iónica” para referirse a estas técnicas, y a partir de entonces se utilizó como nombre para fines comerciales. Hoy en día, la cromatografía iónica es importante para investigar sistemas acuosos, como el agua potable. Es un método popular para analizar elementos aniónicos o complejos que ayudan a resolver problemas de relevancia ambiental. Asimismo, también tiene grandes usos en la industria de semiconductores . [18]
Debido a la abundancia de columnas de separación, sistemas de elución y detectores disponibles, la cromatografía se ha convertido en el método principal para el análisis de iones. [19]
Cuando se desarrolló inicialmente esta técnica, se utilizaba principalmente para el tratamiento del agua. Desde 1935, la cromatografía de intercambio iónico se convirtió rápidamente en una de las técnicas más utilizadas, y sus principios se aplican a menudo a la mayoría de los campos de la química, incluida la destilación, la adsorción y la filtración. [20]
La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas en función de sus respectivos grupos cargados. La cromatografía de intercambio iónico retiene las moléculas de analito en la columna en función de las interacciones coulombianas (iónicas). La matriz de cromatografía de intercambio iónico consta de iones con carga positiva y negativa. [21] Básicamente, las moléculas experimentan interacciones electrostáticas con cargas opuestas en la matriz de la fase estacionaria. La fase estacionaria consta de una matriz inmóvil que contiene grupos funcionales ionizables cargados o ligandos . [22] La superficie de la fase estacionaria muestra grupos funcionales iónicos (RX) que interactúan con iones de analito de carga opuesta. Para lograr la electroneutralidad, estas cargas inmovilizadas se acoplan con contraiones intercambiables en la solución. Las moléculas ionizables que se van a purificar compiten con estos contraiones intercambiables para unirse a las cargas inmovilizadas en la fase estacionaria. Estas moléculas ionizables se retienen o eluyen en función de su carga. Inicialmente, las moléculas que no se unen o se unen débilmente a la fase estacionaria son las primeras en eliminarse. Se necesitan condiciones alteradas para la elución de las moléculas que se unen a la fase estacionaria. La concentración de los contraiones intercambiables, que compiten con las moléculas por la unión, se puede aumentar, o se puede cambiar el pH para afectar la carga iónica del eluyente o del soluto. Un cambio en el pH afecta la carga de las moléculas particulares y, por lo tanto, altera su unión. Al reducir la carga neta de las moléculas del soluto, comienzan a eluirse. De esta manera, dichos ajustes se pueden utilizar para liberar las proteínas de interés. Además, la concentración de contraiones se puede variar gradualmente para afectar la retención de las moléculas ionizadas, separándolas así. Este tipo de elución se llama elución en gradiente. Por otro lado, se puede utilizar la elución por pasos, en la que la concentración de contraiones se varía en pasos. [5] Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico . Las moléculas con carga positiva se unen a las resinas de intercambio catiónico, mientras que las moléculas con carga negativa se unen a las resinas de intercambio aniónico. [23] El compuesto iónico que consiste en la especie catiónica M+ y la especie aniónica B− puede ser retenido por la fase estacionaria.
La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados positivamente porque la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente:
La cromatografía de intercambio aniónico retiene aniones utilizando un grupo funcional cargado positivamente:
Tenga en cuenta que la fuerza iónica de C+ o A− en la fase móvil se puede ajustar para cambiar la posición de equilibrio y, por lo tanto, el tiempo de retención.
El cromatograma iónico muestra un cromatograma típico obtenido con una columna de intercambio de aniones.
Antes de iniciar la cromatografía de intercambio iónico, se debe equilibrar. La fase estacionaria debe equilibrarse según ciertos requisitos que dependen del experimento con el que se esté trabajando. Una vez equilibrado, los iones cargados en la fase estacionaria se unirán a sus iones intercambiables de carga opuesta, como Cl - o Na + . A continuación, se debe elegir un tampón al que se pueda unir la proteína deseada. Después del equilibrio, es necesario lavar la columna. La fase de lavado ayudará a eluir todas las impurezas que no se unen a la matriz mientras que la proteína de interés permanece unida. Este tampón de muestra debe tener el mismo pH que el tampón utilizado para el equilibrio para ayudar a unir las proteínas deseadas. Las proteínas no cargadas se eluirán de la columna a una velocidad similar a la del tampón que fluye a través de la columna sin retención. Una vez que la muestra se ha cargado en la columna y la columna se ha lavado con el tampón para eluir todas las proteínas no deseadas, se lleva a cabo la elución en condiciones específicas para eluir las proteínas deseadas que están unidas a la matriz. Las proteínas unidas se eluyen utilizando un gradiente de concentración de sal que aumenta linealmente. Con el aumento de la fuerza iónica del tampón, los iones de sal competirán con las proteínas deseadas para unirse a los grupos cargados en la superficie del medio. Esto hará que las proteínas deseadas se eluyan de la columna. Las proteínas que tienen una carga neta baja se eluyen primero a medida que aumenta la concentración de sal, lo que hace que aumente la fuerza iónica. Las proteínas con una carga neta alta necesitarán una fuerza iónica más alta para que se las eluya de la columna. [21]
Es posible realizar cromatografía de intercambio iónico en masa, sobre capas delgadas de medio, como placas de vidrio o plástico recubiertas con una capa de la fase estacionaria deseada, o en columnas de cromatografía. La cromatografía en capa delgada o en columna comparten similitudes en el sentido de que ambas actúan dentro de los mismos principios rectores; hay un intercambio constante y frecuente de moléculas a medida que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria. No es imperativo agregar la muestra en volúmenes diminutos, ya que las condiciones predeterminadas para la columna de intercambio se han elegido de modo que haya una fuerte interacción entre las fases móvil y estacionaria. Además, el mecanismo del proceso de elución provocará una compartimentación de las diferentes moléculas en función de sus respectivas características químicas. Este fenómeno se debe a un aumento de las concentraciones de sal en la parte superior de la columna o cerca de ella, lo que desplaza las moléculas en esa posición, mientras que las moléculas unidas más abajo se liberan en un punto posterior cuando la mayor concentración de sal alcanza esa área. Estos principios son las razones por las que la cromatografía de intercambio iónico es un excelente candidato para los pasos iniciales de cromatografía en un procedimiento de purificación complejo, ya que puede producir rápidamente pequeños volúmenes de moléculas objetivo independientemente de un volumen inicial mayor. [6]
A menudo se utilizan dispositivos relativamente simples para aplicar contraiones de gradiente creciente a una columna de cromatografía. Los contraiones como el cobre (II) se eligen con mayor frecuencia para separar eficazmente péptidos y aminoácidos mediante la formación de complejos. [24]
Se puede utilizar un dispositivo sencillo para crear un gradiente de sal. El tampón de elución se extrae de forma constante de la cámara hacia la cámara de mezcla, alterando así su concentración. Por lo general, el tampón colocado en la cámara suele tener una concentración inicial alta, mientras que el tampón colocado en la cámara agitada suele tener una concentración baja. A medida que el tampón de alta concentración de la cámara izquierda se mezcla y se introduce en la columna, la concentración del tampón de la columna agitada aumenta gradualmente. Al alterar las formas de la cámara agitada, así como del tampón límite, se pueden producir gradientes cóncavos, lineales o convexos de contraión.
Se utilizan numerosos medios diferentes para la fase estacionaria. Entre los grupos cargados inmovilizados más comunes se encuentran el trimetilaminoetilo (TAM), el trietilaminoetilo (TEAE), el dietil-2-hidroxipropilaminoetilo (QAE), el aminoetilo (AE), el dietilaminoetilo (DEAE), el sulfo (S), el sulfometilo (SM), el sulfopropilo (SP), el carboxi (C) y el carboximetilo (CM). [5]
El empaque exitoso de la columna es un aspecto importante de la cromatografía iónica. La estabilidad y eficiencia de una columna final depende de los métodos de empaque, el solvente utilizado y los factores que afectan las propiedades mecánicas de la columna. A diferencia de los métodos de empaque en seco ineficientes anteriores, el empaque en suspensión húmeda, en el que las partículas que están suspendidas en un solvente apropiado se introducen en una columna bajo presión, muestra una mejora significativa. Se pueden emplear tres enfoques diferentes para realizar el empaque en suspensión húmeda: el método de densidad equilibrada (la densidad del solvente es aproximadamente la de las partículas de sílice porosa), el método de alta viscosidad (se utiliza un solvente de alta viscosidad) y el método de suspensión de baja viscosidad (realizado con solventes de baja viscosidad). [25]
El poliestireno se utiliza como medio de intercambio iónico. Se obtiene a partir de la polimerización del estireno con el uso de divinilbenceno y peróxido de benzoilo. Estos intercambiadores forman interacciones hidrófobas con las proteínas que pueden ser irreversibles. Debido a esta propiedad, los intercambiadores de iones de poliestireno no son adecuados para la separación de proteínas. Por otro lado, se utilizan para la separación de moléculas pequeñas en la separación de aminoácidos y la eliminación de sal del agua. Los intercambiadores de iones de poliestireno con poros grandes se pueden utilizar para la separación de proteínas, pero deben estar recubiertos con una sustancia hidrófila. [26]
El medio a base de celulosa se puede utilizar para la separación de moléculas grandes, ya que contiene poros grandes. La unión de proteínas en este medio es alta y tiene un carácter hidrofóbico bajo. DEAE es una matriz de intercambio aniónico que se produce a partir de un grupo lateral positivo de dietilaminoetilo unido a celulosa o Sephadex. [27]
Los medios a base de gel de agarosa también contienen poros grandes, pero su capacidad de sustitución es menor en comparación con los dextranos. La capacidad del medio para hincharse en líquido se basa en la reticulación de estas sustancias, el pH y las concentraciones iónicas de los tampones utilizados. [26]
La incorporación de altas temperaturas y presiones permite un aumento significativo en la eficiencia de la cromatografía iónica, junto con una disminución en el tiempo. La temperatura tiene una influencia en la selectividad debido a sus efectos en las propiedades de retención. El factor de retención ( k = ( t R g − t M g )/( t M g − t ext )) aumenta con la temperatura para iones pequeños, y se observa la tendencia opuesta para iones más grandes. [28] [29]
A pesar de la selectividad de iones en diferentes medios, se están realizando más investigaciones para realizar cromatografía de intercambio iónico en el rango de 40 a 175 °C. [30]
Se puede elegir un disolvente adecuado en función de las observaciones de cómo se comportan las partículas de la columna en un disolvente. Con un microscopio óptico, se puede distinguir fácilmente un estado disperso deseable de la suspensión de partículas agregadas. [25]
Un intercambiador de iones "fuerte" no perderá la carga de su matriz una vez que la columna esté equilibrada, por lo que se puede utilizar una amplia gama de tampones de pH. Los intercambiadores de iones "débiles" tienen un rango de valores de pH en los que mantendrán su carga. Si el pH del tampón utilizado para una columna de intercambio de iones débil se sale del rango de capacidad de la matriz, la columna perderá su distribución de carga y la molécula de interés puede perderse. [31] A pesar del rango de pH más pequeño de los intercambiadores de iones débiles, a menudo se utilizan en lugar de los intercambiadores de iones fuertes debido a que tienen una mayor especificidad. En algunos experimentos, los tiempos de retención de los intercambiadores de iones débiles son lo suficientemente largos como para obtener los datos deseados con una alta especificidad. [32]
Las resinas (a menudo denominadas "perlas") de las columnas de intercambio iónico pueden incluir grupos funcionales como ácidos débiles/fuertes y bases débiles/fuertes. También hay columnas especiales que tienen resinas con grupos funcionales anfóteros que pueden intercambiar tanto cationes como aniones. [33] Algunos ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico fuerte son el catión amonio cuaternario (Q), que es un intercambiador de aniones, y el ácido sulfónico (S, -SO 2 OH), que es un intercambiador de cationes. [34] Estos tipos de intercambiadores pueden mantener su densidad de carga en un rango de pH de 0 a 14. Los ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico débil incluyen dietilaminoetilo (DEAE, -C 2 H 4 N(C 2 H 5 ) 2 ), que es un intercambiador de aniones, y carboximetilo (CM, -CH 2 -COOH), [35] que es un intercambiador de cationes. Estos dos tipos de intercambiadores pueden mantener la densidad de carga de sus columnas en un rango de pH de 5 a 9. [ cita requerida ]
En la cromatografía iónica, la interacción de los iones del soluto y la fase estacionaria en función de sus cargas determina qué iones se unirán y en qué grado. Cuando la fase estacionaria presenta grupos positivos que atraen aniones, se denomina intercambiador de aniones; cuando hay grupos negativos en la fase estacionaria, se atraen cationes y se trata de un intercambiador de cationes. [36] La atracción entre iones y fase estacionaria también depende de la resina y de las partículas orgánicas utilizadas como intercambiadores de iones.
Cada resina presenta una selectividad relativa que varía en función de los iones de soluto presentes que competirán por unirse al grupo de resina en la fase estacionaria. El coeficiente de selectividad, el equivalente a la constante de equilibrio, se determina a través de una relación de las concentraciones entre la resina y cada ion; sin embargo, la tendencia general es que los intercambiadores de iones prefieren unirse al ion con una carga más alta, un radio hidratado más pequeño y una mayor polarizabilidad, o la capacidad de que la nube de electrones de un ion se vea alterada por otras cargas. [37] A pesar de esta selectividad, las cantidades excesivas de un ion con una selectividad menor introducidas en la columna harían que el ion menor se uniera más a la fase estacionaria, ya que el coeficiente de selectividad permite fluctuaciones en la reacción de unión que tiene lugar durante la cromatografía de intercambio iónico.
La siguiente tabla muestra los intercambiadores de iones comúnmente utilizados [38]
Se introduce una muestra, ya sea manualmente o con un muestreador automático , en un bucle de muestra de volumen conocido. Una solución acuosa tamponada conocida como fase móvil transporta la muestra desde el bucle a una columna que contiene algún tipo de material de fase estacionaria. Normalmente, se trata de una matriz de resina o gel que consta de perlas de agarosa o celulosa con grupos funcionales cargados unidos covalentemente . Es necesario equilibrar la fase estacionaria para obtener la carga deseada de la columna. Si la columna no está correctamente equilibrada, es posible que la molécula deseada no se una con fuerza a la columna. Los analitos objetivo (aniones o cationes) se retienen en la fase estacionaria, pero se pueden eluir aumentando la concentración de una especie con carga similar que desplaza los iones del analito de la fase estacionaria. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio catiónico, el analito con carga positiva se puede desplazar añadiendo iones de sodio con carga positiva. A continuación, los analitos de interés se deben detectar por algún medio, normalmente por conductividad o absorbancia de luz UV/visible.
Para controlar un sistema de cromatografía de gases, normalmente se necesita un sistema de datos cromatográficos (CDS). Además de los sistemas de cromatografía de gases, algunos de estos CDS también pueden controlar la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Un tipo de cromatografía de intercambio iónico, el intercambio de membrana [39] [40] es un método relativamente nuevo de purificación diseñado para superar las limitaciones del uso de columnas llenas de perlas. Los dispositivos cromatográficos de membrana [41] [42] son baratos de producir en masa y desechables a diferencia de otros dispositivos de cromatografía que requieren mantenimiento y tiempo para revalidar. Hay tres tipos de absorbentes de membrana que se utilizan normalmente al separar sustancias. Los tres tipos son láminas planas, fibra hueca y flujo radial. El absorbente más común y el más adecuado para la cromatografía de membrana es el de múltiples láminas planas porque tiene más volumen absorbente. Se puede utilizar para superar las limitaciones de transferencia de masa [43] y la caída de presión, [44] lo que lo hace especialmente ventajoso para aislar y purificar virus, ADN plasmídico y otras macromoléculas grandes. La columna está llena de membranas microporosas con poros internos que contienen fracciones adsorbentes que pueden unirse a la proteína objetivo. Las membranas adsorbentes están disponibles en una variedad de geometrías y químicas que permiten su uso para purificación y también fraccionamiento, concentración y clarificación con una eficiencia que es diez veces mayor que la del uso de perlas. [45] Las membranas se pueden preparar mediante el aislamiento de la propia membrana, donde las membranas se cortan en cuadrados y se inmovilizan. Un método más reciente implicó el uso de células vivas que se adhieren a una membrana de soporte y se utilizan para la identificación y clarificación de moléculas de señalización. [46]
La cromatografía de intercambio iónico se puede utilizar para separar proteínas porque contienen grupos funcionales cargados. Los iones de interés (en este caso, proteínas cargadas) se intercambian por otros iones (normalmente H + ) en un soporte sólido cargado. Los solutos se encuentran más comúnmente en una fase líquida, que tiende a ser agua. Tomemos como ejemplo las proteínas en agua, que sería una fase líquida que pasa a través de una columna. La columna se conoce comúnmente como la fase sólida, ya que está llena de partículas sintéticas porosas que tienen una carga particular. Estas partículas porosas también se denominan perlas, pueden estar aminadas (que contienen grupos amino) o tener iones metálicos para tener una carga. La columna se puede preparar utilizando polímeros porosos, para macromoléculas de una masa de más de 100 000 Da, el tamaño óptimo de la partícula porosa es de aproximadamente 1 μm2 . Esto se debe a que la difusión lenta de los solutos dentro de los poros no restringe la calidad de la separación. [47] Las perlas que contienen grupos cargados positivamente, que atraen a las proteínas cargadas negativamente, se denominan comúnmente resinas de intercambio aniónico. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH 7 (pH del agua) son glutamato y aspartato. Las perlas que están cargadas negativamente se denominan resinas de intercambio catiónico, ya que las proteínas cargadas positivamente serán atraídas. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH 7 son lisina, histidina y arginina. [48]
El punto isoeléctrico es el pH en el que un compuesto -en este caso una proteína- no tiene carga neta. El punto isoeléctrico de una proteína o PI se puede determinar utilizando el pKa de las cadenas laterales, si el amino (cadena positiva) es capaz de cancelar la cadena carboxilo (negativa), la proteína estaría en su PI. El uso de tampones en lugar de agua para proteínas que no tienen una carga a pH 7 es una buena idea, ya que permite la manipulación del pH para alterar las interacciones iónicas entre las proteínas y las perlas. [49] Las cadenas laterales débilmente ácidas o básicas pueden tener una carga si el pH es lo suficientemente alto o bajo respectivamente. La separación se puede lograr en función del punto isoeléctrico natural de la proteína. Alternativamente, se puede agregar genéticamente una etiqueta de péptido a la proteína para darle a la proteína un punto isoeléctrico alejado de la mayoría de las proteínas naturales (por ejemplo, 6 argininas para unirse a una resina de intercambio catiónico o 6 glutamatos para unirse a una resina de intercambio aniónico como DEAE-Sepharose).
La elución mediante el aumento de la fuerza iónica de la fase móvil es más sutil. Funciona porque los iones de la fase móvil interactúan con los iones inmovilizados en la fase estacionaria, lo que "protege" la fase estacionaria de la proteína y permite que la proteína se eluya.
La elución de las columnas de intercambio iónico puede ser sensible a los cambios de una sola carga: cromatoenfoque . La cromatografía de intercambio iónico también es útil en el aislamiento de conjuntos de proteínas multiméricas específicas, lo que permite la purificación de complejos específicos de acuerdo con el número y la posición de las etiquetas de péptidos cargados. [50] [51]
En la cromatografía de intercambio iónico, el efecto Gibbs-Donnan se observa cuando el pH del tampón aplicado y el intercambiador de iones difieren, incluso hasta en una unidad de pH. Por ejemplo, en las columnas de intercambio aniónico, los intercambiadores de iones rechazan protones, por lo que el pH del tampón cerca de la columna es mayor que el del resto del disolvente. [52] Como resultado, un experimentador debe tener cuidado de que la(s) proteína(s) de interés sea(n) estable(s) y esté(n) correctamente cargada(s) en el pH "real".
Este efecto se produce como resultado de que dos partículas con carga similar, una de la resina y otra de la solución, no se distribuyen adecuadamente entre los dos lados; hay una absorción selectiva de un ion sobre otro. [53] [54] Por ejemplo, en una resina de poliestireno sulfonado, una resina de intercambio catiónico, el ion cloro de un tampón de ácido clorhídrico debería equilibrarse en la resina. Sin embargo, dado que la concentración del ácido sulfónico en la resina es alta, el hidrógeno del HCl no tiene tendencia a entrar en la columna. Esto, combinado con la necesidad de electroneutralidad, conduce a una cantidad mínima de hidrógeno y cloro que ingresa a la resina. [54]
Un uso de la cromatografía iónica se puede ver en la cromatografía de argentación . [ cita requerida ] Por lo general, la plata y los compuestos que contienen enlaces acetilénicos y etilénicos tienen interacciones muy débiles. Este fenómeno ha sido ampliamente probado en compuestos de olefina. Los complejos iónicos que las olefinas forman con iones de plata son débiles y se forman en base a la superposición de orbitales pi, sigma y d y los electrones disponibles, por lo tanto, no causan cambios reales en el doble enlace. Este comportamiento se manipuló para separar lípidos, principalmente ácidos grasos de mezclas en fracciones con diferente número de dobles enlaces utilizando iones de plata. Las resinas iónicas se impregnaron con iones de plata, que luego se expusieron a varios ácidos (ácido silícico) para eluir ácidos grasos de diferentes características.
Se pueden obtener límites de detección tan bajos como 1 μM para iones de metales alcalinos. [55] Puede usarse para la medición de HbA1c , porfirina y con purificación de agua . Las resinas de intercambio iónico (IER) se han utilizado ampliamente, especialmente en medicamentos, debido a su alta capacidad y al sistema sencillo del proceso de separación. Uno de los usos sintéticos es utilizar resinas de intercambio iónico para diálisis renal. Este método se utiliza para separar los elementos sanguíneos utilizando el riñón artificial con membrana de celulosa. [56]
Otra aplicación clínica de la cromatografía iónica es la técnica de cromatografía de intercambio aniónico rápido utilizada para separar las isoenzimas de la creatina quinasa (CK) del suero humano y del tejido obtenido de material de autopsia (se utilizaron principalmente tejidos ricos en CK, como el músculo cardíaco y el cerebro). [ cita requerida ] Estas isoenzimas incluyen MM, MB y BB, que llevan a cabo la misma función dadas diferentes secuencias de aminoácidos. Las funciones de estas isoenzimas son convertir la creatina, utilizando ATP, en fosfocreatina expulsando ADP. Las minicolumnas se llenaron con DEAE-Sephadex A-50 y se eluyeron posteriormente con cloruro de sodio tampón tris a varias concentraciones (cada concentración se eligió ventajosamente para manipular la elución). El extracto de tejido humano se insertó en columnas para la separación. Se analizaron todas las fracciones para ver la actividad total de CK y se encontró que cada fuente de isoenzimas de CK tenía isoenzimas características encontradas dentro. En primer lugar se eluyó la CK-MM, luego la CK-MB y finalmente la CK-BB, por lo que las isoenzimas encontradas en cada muestra se pudieron utilizar para identificar la fuente, ya que eran específicas del tejido.
Utilizando la información de los resultados, se pudo establecer una correlación entre el diagnóstico de los pacientes y el tipo de isoenzimas CK que se encontraron en actividad más abundante. A partir del hallazgo, aproximadamente 35 de los 71 pacientes estudiados que sufrieron un ataque cardíaco (infarto de miocardio) también contenían una cantidad abundante de las isoenzimas CK-MM y CK-MB. Los hallazgos muestran además que muchos otros diagnósticos, como insuficiencia renal, enfermedad cerebrovascular y enfermedad pulmonar, solo tenían la isoenzima CK-MM y ninguna otra isoenzima. Los resultados de este estudio indican correlaciones entre varias enfermedades y las isoenzimas CK encontradas, lo que confirma los resultados de pruebas anteriores utilizando varias técnicas. Los estudios sobre CK-MB encontrados en víctimas de ataques cardíacos se han ampliado desde este estudio y la aplicación de la cromatografía iónica.
Desde 1975, la cromatografía iónica se ha utilizado ampliamente en muchas ramas de la industria. Las principales ventajas beneficiosas son la confiabilidad, muy buena exactitud y precisión, alta selectividad, alta velocidad, alta eficiencia de separación y bajo costo de los consumibles. El desarrollo más significativo relacionado con la cromatografía iónica son los nuevos métodos de preparación de muestras; mejora de la velocidad y selectividad de la separación de analitos; reducción de los límites de detección y límites de cuantificación; ampliación del alcance de las aplicaciones; desarrollo de nuevos métodos estándar; miniaturización y ampliación del alcance del análisis de un nuevo grupo de sustancias. Permite la prueba cuantitativa de electrolitos y aditivos patentados de baños de galvanoplastia . [57] Es un avance de la prueba cualitativa de celda de casco o prueba UV menos precisa. Se pueden medir iones, catalizadores, abrillantadores y aceleradores. [57] La cromatografía de intercambio iónico se ha convertido gradualmente en una técnica universal ampliamente conocida para la detección de especies aniónicas y catiónicas. Se han desarrollado o están en desarrollo aplicaciones para tales fines en diversos campos de interés, en particular en la industria farmacéutica. El uso de la cromatografía de intercambio iónico en productos farmacéuticos ha aumentado en los últimos años y en 2006 se añadió oficialmente un capítulo sobre cromatografía de intercambio iónico al Formulario Nacional de la Farmacia de los Estados Unidos (USP-NF). Además, en la publicación de 2009 del USP-NF, la Farmacia de los Estados Unidos puso a disposición varios análisis de cromatografía iónica utilizando dos técnicas: detección de conductividad y detección amperométrica de pulso . La mayoría de estas aplicaciones se utilizan principalmente para medir y analizar límites residuales en productos farmacéuticos, incluida la detección de límites de oxalato, yoduro, sulfato, sulfamato, fosfato, así como varios electrolitos, incluidos potasio y sodio. En total, la edición de 2009 del USP-NF publicó oficialmente veintiocho métodos de detección para el análisis de compuestos activos o componentes de compuestos activos, utilizando detección de conductividad o detección amperométrica de pulso. [58]
Ha habido un creciente interés en la aplicación de la CI en el análisis de fármacos farmacéuticos. La CI se utiliza en diferentes aspectos del desarrollo de productos y pruebas de control de calidad. Por ejemplo, la CI se utiliza para mejorar las propiedades de estabilidad y solubilidad de las moléculas de fármacos activos farmacéuticos, así como para detectar sistemas que tienen una mayor tolerancia a los disolventes orgánicos. La CI se ha utilizado para la determinación de analitos como parte de una prueba de disolución. Por ejemplo, las pruebas de disolución de calcio han demostrado que otros iones presentes en el medio pueden resolverse bien entre sí y también a partir del ión calcio. Por lo tanto, la CI se ha empleado en fármacos en forma de comprimidos y cápsulas para determinar la cantidad de fármaco disuelto con el tiempo. [59] La CI también se utiliza ampliamente para la detección y cuantificación de excipientes o ingredientes inactivos utilizados en formulaciones farmacéuticas. La detección de azúcar y alcohol de azúcar en dichas formulaciones a través de la CI se ha realizado debido a que estos grupos polares se resuelven en la columna de iones. La metodología de la CI también se estableció en el análisis de impurezas en sustancias y productos farmacéuticos. Se evalúan las impurezas o cualquier componente que no forme parte de la entidad química del fármaco y proporcionan información sobre las cantidades máximas y mínimas de fármaco que se deben administrar a un paciente por día. [60]
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