La desoxirribonucleasa ( DNasa , para abreviar) se refiere a un grupo de endonucleasas de glicoproteína que son enzimas que catalizan la escisión hidrolítica de los enlaces fosfodiéster en la cadena principal del ADN , degradando así el ADN. El papel de la enzima DNasa en las células incluye la descomposición del ADN extracelular (ecDNA) excretado por apoptosis , necrosis y trampas extracelulares de neutrófilos (NET) de las células para ayudar a reducir las respuestas inflamatorias que de otro modo se desencadenan. Se conoce una amplia variedad de desoxirribonucleasas y se dividen en una de dos familias ( DNasa I o DNasa II ), que difieren en sus especificidades de sustrato , mecanismos químicos y funciones biológicas. Las aplicaciones de laboratorio de la DNasa incluyen la purificación de proteínas cuando se extraen de organismos procariotas . Además, la DNasa se ha aplicado como tratamiento para enfermedades causadas por ecDNA en el plasma sanguíneo. Los ensayos de DNasa también están surgiendo en el campo de la investigación.
Los dos tipos principales de DNasa que se encuentran en los animales se conocen como desoxirribonucleasa I (DNasa I) y desoxirribonucleasa II (DNasa II). Estas dos familias tienen subcategorías dentro de ellas.
El primer grupo de DNasas es la DNasa I. Esta familia constaba de DNasa I, DNasa1L1 , DNasa 1L2 y DNasa1L3 . La DNasa I escinde el ADN para formar dos productos finales de oligonucleótidos con extremos 5'-fosfo y 3'-hidroxi y se produce principalmente en los órganos del sistema digestivo . La familia de las DNasas I requiere cationes Ca2+ y Mg2+ como activadores y se expresan de forma selectiva. [1] En términos de pH, la familia de las DNasas I es activa en un pH normal de alrededor de 6,5 a 8.
El segundo grupo de ADNasas es la ADNasa II. Esta familia está formada por la ADNasa II α y la ADNasa II β. Al igual que la ADNasa I, la ADNasa II escinde el ADN para formar dos productos finales de oligonucleótidos con extremos 5'-hidroxi y 3'-fosfo. Este tipo de ADNasa se expresa más ampliamente en los tejidos debido a su alta expresión en los macrófagos, pero su expresión limitada en el tipo celular. A diferencia de la ADNasa I, no necesitan cationes Ca2+ y Mg2+ como activadores. [2] En términos de pH , la familia de la ADNasa II se expresa en pH ácido. El patrón de escisión de la ADNasa II se altera en presencia de dimetilsulfóxido ( DMSO ), que afecta significativamente a la estructura del ADN.
Aunque tanto la ADNasa I como la ADNasa II son endonucleasas de glicoproteína, la ADNasa I tiene una estructura tipo sándwich monomérica con una cadena lateral de carbohidratos, mientras que la ADNasa II tiene una estructura cuaternaria dimérica .
Estructura de la ADNasa I: La ADNasa I es una glicoproteína con un peso molecular de 30 000 Da y una cadena de carbohidratos de 8-10 residuos unida a Asn18 (naranja). [3] Es una proteína 𝛼,𝛽 con dos láminas plegadas 𝛽 de 6 hebras que forman el núcleo de la estructura. [4] Estas dos láminas centrales corren paralelas y todas las demás corren antiparalelas. Las láminas plegadas 𝛽 se encuentran en el centro de la estructura, mientras que las hélices 𝛼 se indican mediante las bobinas en la periferia. La ADNasa I contiene cuatro bolsillos de unión de iones y requiere Ca 2+ y Mg 2+ para hidrolizar el ADN bicatenario. [5] Dos de los sitios se unen fuertemente al Ca 2+ mientras que los otros dos coordinan al Mg 2+ . Se ha publicado poco sobre el número y la ubicación de los sitios de unión de Mg 2+ , aunque se ha propuesto que Mg 2+ se encuentra cerca del bolsillo catalítico y contribuye a la hidrólisis. [6] Los dos Ca 2+ se muestran en rojo en la imagen. Están unidos a la DNasa I en condiciones de cristalización y son importantes para la integridad estructural de la molécula al estabilizar el bucle de superficie Asp198 a Thr204 (cian) y al limitar la región de alta movilidad térmica en el bucle flexible a los residuos Gly97 a Gly102 (amarillo).
Estructura de la ADNasa II: La ADNasa II contiene una estructura cuaternaria homodímera que es capaz de unir ADN bicatenario dentro de una arquitectura de abrazadera en forma de U. El interior de la abrazadera en forma de U es en gran parte electropositivo, capaz de unir ADN cargado negativamente. Similar a la ADNasa I, la estructura de la ADNasa II consiste en una estructura secundaria mixta 𝛼/𝛽 con 9 hélices 𝛼 y 20 láminas plegadas 𝛽. [7] Aunque a diferencia de la ADNasa I, la ADNasa II no requiere iones metálicos divalentes para la catálisis. [7] La estructura consiste en el protómero A (cian) y el protómero B (verde). Cada estructura consiste en dos motivos catalíticos, que están etiquetados en el protómero B para simplificar: His100 y Lys102 componen el primer motivo (azul) e His279 y Lys281 componen el segundo motivo catalítico (rojo).
Algunas ADNasas cortan, o "escinden", solo residuos en los extremos de las moléculas de ADN. Este tipo de exonucleasa se conoce como exodesoxirribonucleasas . Otras escinden en cualquier parte a lo largo de la cadena, conocidas como endodesoxirribonucleasas (un subconjunto de endonucleasas ). [8] Algunas ADNasas son bastante indiscriminadas sobre la secuencia de ADN en la que cortan, mientras que otras, incluidas las enzimas de restricción , son muy específicas de la secuencia. Otras ADNasas escinden solo ADN de doble cadena , otras son específicas para moléculas de cadena sencilla y otras son activas hacia ambas.
La acción de la DNasa se produce en tres fases. La fase inicial introduce múltiples cortes en la cadena principal del fosfodiéster . La segunda fase produce nucleótidos solubles en ácido. La tercera fase, que es la fase terminal, consiste en la reducción de oligonucleótidos, lo que provoca un cambio hipercrómico en los datos UV. [9]
La DNasa I se dirige predominantemente al ADN bicatenario y, en menor medida, a algo de ADN monocatenario para la escisión. La DNasa I cataliza la escisión no específica del ADN cortando los enlaces fosfodiéster en una de las hebras. Su sitio de escisión se encuentra entre el átomo de oxígeno 3' y el átomo de fósforo adyacente, produciendo oligonucleótidos 3'-hidroxilo y 5'-fosforilo con inversión de configuración en el fósforo. La enzima DNasa depende de la presencia de un catión divalente , que normalmente es Ca 2+ , para su correcto funcionamiento. El sitio activo de la DNasa I incluye dos residuos de histidina (His134 y His252) y dos residuos ácidos ( Glu 78 y Asp 212), todos ellos críticos para la catálisis ácido-base general de los enlaces fosfodiéster. [10]
La desoxirribonucleasa II (DNasa II) también se conoce como desoxirribonucleasa ácida porque tiene una actividad óptima en el entorno de pH bajo de los lisosomas, donde se encuentra típicamente en eucariotas superiores. Algunas formas de DNasa II recombinante muestran un alto nivel de actividad en pH bajo en ausencia de iones metálicos divalentes, similar a la DNasa II eucariota. [7] A diferencia de la DNasa I, la DNasa II escinde el enlace fosfodiéster entre el átomo de oxígeno 5' y el átomo de fósforo adyacente, produciendo nucleótidos 3΄-fosforilados y 5΄-hidroxilo.
La DNasa se utiliza comúnmente para purificar proteínas extraídas de organismos procariotas . La extracción de proteínas a menudo implica la degradación de la membrana celular . Es común que la membrana celular degradada y frágil se lise , liberando ADN no deseado y las proteínas deseadas. El extracto de proteína y ADN resultante es muy viscoso y difícil de purificar, en cuyo caso se agrega DNasa para descomponerlo. [11] El ADN se hidroliza , pero las proteínas no se ven afectadas y el extracto puede someterse a una purificación adicional.
El ADN extracelular (ecDNA) es el ADN que se encuentra en la circulación sanguínea. Aparece como resultado de la apoptosis , necrosis o trampas extracelulares de neutrófilos (NET)-osis de las células sanguíneas y tisulares, pero también puede surgir de la secreción activa de células vivas. El ecDNA y sus proteínas de unión al ADN designadas pueden activar receptores de detección de ADN, receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Los PRR pueden estimular vías que causan una respuesta inmunitaria inflamatoria. Como resultado, varios estudios de enfermedades inflamatorias han encontrado que existen altas concentraciones de ecDNA en el plasma sanguíneo. Por esta razón, la DNasa ha demostrado ser un posible tratamiento para la reducción de ecDNA en el plasma sanguíneo. Las DNasas pueden excretarse tanto intracelularmente como extracelularmente y pueden escindir el enlace fosfodiéster del ADN . Esta función se puede utilizar para mantener una baja concentración de ecDNA, tratando así la inflamación. Las enfermedades que resultan de los residuos de ADN en la sangre se han tratado utilizando las "propiedades de descomposición" de la DNasa. Los estudios han demostrado que la DNasa puede actuar como tratamiento al disminuir la viscosidad del moco. [12] [13] La administración de DNasa varía según la enfermedad. Puede administrarse y se ha administrado por vía oral , intrapleural, intravenosa , intraperitoneal y por inhalación . [14] Varios estudios continúan examinando la aplicación de la DNasa como tratamiento, así como formas de monitorear la salud. Por ejemplo, recientemente, la DNasa derivada de bacterias patógenas se ha utilizado como un indicador para el monitoreo de infecciones de heridas. [15]
La fibrosis quística es un trastorno genético que afecta la producción de moco, sudor y fluidos digestivos, haciendo que se vuelvan más viscosos en lugar de lubricantes . Las enzimas DNasa pueden ser inhaladas usando un nebulizador por los pacientes con fibrosis quística . Las enzimas DNasa ayudan porque los glóbulos blancos se acumulan en el moco y, cuando se descomponen, liberan ADN, lo que aumenta la "pegajosidad" del moco. Las enzimas DNasa descomponen el ADN y el moco es mucho más fácil de eliminar de los pulmones. Específicamente, la DNasa I, también conocida como el fármaco aprobado por la FDA Pulmozyme (también conocido como dornasa alfa) se usa como tratamiento para aumentar la función pulmonar.
También se ha descubierto que otras enfermedades respiratorias como el asma , [16] el empiema pleural , [12] y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica se ven afectadas positivamente por las propiedades de las DNasas.
Además, estudios recientes muestran que el activador tisular del plasminógeno intrapleural (tPA), una proteína responsable de la descomposición de los coágulos sanguíneos, combinado con la desoxirribonucleasa aumenta el drenaje pleural, disminuye la duración de la estancia hospitalaria y disminuye la necesidad de cirugía en derrames paraneumónicos y empiema .
La sepsis es una enfermedad inflamatoria potencialmente mortalcausada por la respuesta extrema del cuerpo a una infección. El cuerpo comienza a atacarse a sí mismo a medida que una respuesta inflamatoria abarca el cuerpo humano. Como resultado, se han asociado altos niveles de ecDNA con el torrente sanguíneo y, por lo tanto, los investigadores han considerado a la DNasa como un tratamiento adecuado. Los estudios han demostrado que la DNasa tuvo éxito en la interrupción de los NET y la disminución de las respuestas inflamatorias. Se necesita más investigación sobre el tipo y el momento de la administración para establecer aún más la DNasa como un tratamiento oficial. [17] [18] [19]
El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune que produce la generación de autoanticuerpos que provocan inflamación que provoca daño a órganos, articulaciones y riñones. El LES se ha relacionado con niveles bajos de DNasa I, ya que las células apoptóticas se convierten en autoantígenos en esta enfermedad. La DNasa I se ha investigado como un posible tratamiento para disminuir la cantidad de restos apoptóticos en el sistema humano. Se ha sugerido que su dificultad podría deberse a la incapacidad de la enzima para descomponer la membrana celular de la cromatina . Los estudios han mostrado resultados contradictorios sobre este tratamiento, sin embargo, se están realizando más investigaciones para examinar los beneficios terapéuticos de la DNasa I. [14] [18] [20]
Tratamiento antitumoral. Se sabe que la DNasa tiene efectos antitumorales debido a su capacidad para descomponer el ADN. Se han encontrado altos niveles de ADN en la sangre de pacientes con cáncer, lo que sugiere que la DNasa I podría ser un posible tratamiento. Todavía no se sabe por qué hay niveles tan altos de ecDNA y si la DNasa actuará o no como un tratamiento efectivo. Varios estudios con ratones han mostrado resultados positivos en la progresión antitumoral utilizando DNasa I intravenosa. Sin embargo, es necesario realizar más investigaciones antes de presentarla al público. [21] [14]
El ADN absorbe la luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda de máxima absorbancia cercana a los 260 nm. Esta absorción se debe a los electrones pi en las bases aromáticas del ADN. En el ADN de doble cadena, o incluso en las regiones del ARN donde se produce una estructura de doble cadena, las bases se apilan en paralelo entre sí, y la superposición de los orbitales moleculares de las bases conduce a una disminución de la absorbancia de la luz UV. Este fenómeno se denomina efecto hipocrómico . Cuando la ADNasa libera nucleótidos del ADN de doble cadena, las bases ya no están apiladas como en el ADN de doble cadena, de modo que la superposición de orbitales se minimiza y la absorbancia UV aumenta. Este aumento de la absorbancia subyace a la base de la unidad Kunitz de la actividad de la ADNasa. Una unidad Kunitz se define como la cantidad de enzima añadida a 1 mg/ml de ADN de esperma de salmón que provoca un aumento de la absorbancia de 0,001 por minuto a la longitud de onda de 260 nm cuando actúa sobre ADN altamente polimerizado a 25 °C en un tampón de NaOAc 0,1 M (pH 5,0). El nombre de la unidad reconoce al bioquímico ruso-estadounidense Moses Kunitz , quien propuso la prueba estándar en 1946. [22]
Una preparación enzimática estándar debe ejecutarse en paralelo con una desconocida porque no es posible la estandarización de las preparaciones de ADN y su grado de polimerización en solución.
Difusión enzimática radial simple (SRED) Este método simple para la medición de la actividad de la DNasa I fue introducido por Nadano et al. y se basa en la digestión del ADN en el gel de agarosa por la DNasa, que está presente en las muestras perforadas en el gel. [14] La actividad de la DNasa está representada por el tamaño de un pocillo circular distribuido en una capa de gel de agarosa, en el que el ADN teñido con bromuro de etidio se distribuye uniformemente. Después de la incubación, se forma una zona oscura circular a medida que la enzima se difunde desde el pocillo radialmente hacia el gel y escinde el ADN. La SRED sufrió muchas modificaciones, lo que llevó a un aumento de la sensibilidad y la seguridad, como el reemplazo del bromuro de etidio con SYBR Green I u otras tinciones de gel de ADN. [23]
Ensayo colorimétrico de actividad de la DNasa I
El ensayo colorimétrico cinético de la actividad de la DNasa I se desarrolló para evaluar la estabilidad de la DNasa I recombinante humana (Pulmozyme). El método se ajustó a partir de un ensayo colorimétrico de actividad enzimática de punto final basado en la degradación de un complejo de ADN/verde de metilo. [24]
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