Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza fluorescencia en lugar de, o además de, dispersión , reflexión y atenuación o absorción , para estudiar las propiedades de sustancias orgánicas o inorgánicas . [1] [2] "Microscopio de fluorescencia" se refiere a cualquier microscopio que utiliza fluorescencia para generar una imagen, ya sea una configuración simple como un microscopio de epifluorescencia o un diseño más complicado como un microscopio confocal , que utiliza seccionamiento óptico para obtener mejor resolución de la imagen de fluorescencia. [3]
La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda (o longitudes de onda) específica que es absorbida por los fluoróforos , lo que hace que emitan luz de longitudes de onda más largas (es decir, de un color diferente al de la luz absorbida). La luz de iluminación se separa de la fluorescencia emitida, mucho más débil, mediante el uso de un filtro de emisión espectral. Los componentes típicos de un microscopio de fluorescencia son una fuente de luz ( la lámpara de arco de xenón o la lámpara de vapor de mercurio son comunes; las formas más avanzadas son los LED y láseres de alta potencia ), el filtro de excitación , el espejo dicroico (o divisor de haz dicroico ) y el sistema de emisión. filtro (ver figura a continuación). Los filtros y el divisor de haz dicroico se eligen para que coincidan con las características espectrales de excitación y emisión del fluoróforo utilizado para marcar la muestra. [1] De esta manera, se obtienen imágenes de la distribución de un solo fluoróforo (color) a la vez. Se deben componer imágenes multicolores de varios tipos de fluoróforos combinando varias imágenes de un solo color. [1]
La mayoría de los microscopios de fluorescencia que se utilizan son microscopios de epifluorescencia, en los que la excitación del fluoróforo y la detección de la fluorescencia se realizan a través del mismo camino de luz (es decir, a través del objetivo). Estos microscopios se utilizan ampliamente en biología y son la base para diseños de microscopios más avanzados, como el microscopio confocal y el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF).
La mayoría de los microscopios de fluorescencia, especialmente los utilizados en las ciencias biológicas , tienen el diseño de epifluorescencia que se muestra en el diagrama. La luz de la longitud de onda de excitación ilumina la muestra a través de la lente del objetivo . La fluorescencia emitida por la muestra es enfocada al detector por el mismo objetivo que se utiliza para la excitación, el cual para mayor resolución necesitará lentes objetivo con mayor apertura numérica . Dado que la mayor parte de la luz de excitación se transmite a través de la muestra, sólo la luz excitadora reflejada llega al objetivo junto con la luz emitida y, por lo tanto, el método de epifluorescencia proporciona una alta relación señal-ruido. El divisor de haz dicroico actúa como un filtro de longitud de onda específica, transmitiendo luz fluorescente al ocular o detector, pero reflejando cualquier luz de excitación restante hacia la fuente. [ cita necesaria ]
La microscopía de fluorescencia requiere una iluminación intensa, casi monocromática, que algunas fuentes de luz muy extendidas, como las lámparas halógenas , no pueden proporcionar. [4] Se utilizan cuatro tipos principales de fuentes de luz, incluidas lámparas de arco de xenón o lámparas de vapor de mercurio con un filtro de excitación , láseres , fuentes supercontinuas y LED de alta potencia . Los láseres se utilizan más ampliamente para técnicas de microscopía de fluorescencia más complejas, como la microscopía confocal y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total , mientras que las lámparas de xenón, las lámparas de mercurio y los LED con un filtro de excitación dicroico se utilizan comúnmente para los microscopios de epifluorescencia de campo amplio. Al colocar dos conjuntos de microlentes en la trayectoria de iluminación de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio, [5] se puede lograr una iluminación altamente uniforme con un coeficiente de variación del 1-2%.
Para que una muestra sea adecuada para microscopía de fluorescencia debe ser fluorescente. Existen varios métodos para crear una muestra fluorescente; las principales técnicas son el marcaje con tinciones fluorescentes o, en el caso de muestras biológicas, la expresión de una proteína fluorescente . Alternativamente, se puede utilizar la fluorescencia intrínseca de una muestra (es decir, autofluorescencia ). [1] En las ciencias biológicas, la microscopía de fluorescencia es una herramienta poderosa que permite la tinción específica y sensible de una muestra para detectar la distribución de proteínas u otras moléculas de interés. Como resultado, existe una amplia gama de técnicas para la tinción fluorescente de muestras biológicas. [ cita necesaria ]
Se han diseñado muchas tinciones fluorescentes para una variedad de moléculas biológicas. Algunas de ellas son moléculas pequeñas que son intrínsecamente fluorescentes y se unen a una molécula biológica de interés. Los principales ejemplos de estos son las tinciones de ácido nucleico como DAPI y Hoechst (excitadas por luz de longitud de onda ultravioleta) y DRAQ5 y DRAQ7 (excitadas de manera óptima por luz roja), que se unen al surco menor del ADN , etiquetando así los núcleos de las células. Otros son fármacos, toxinas o péptidos que se unen a estructuras celulares específicas y se han derivatizado con un indicador fluorescente. Un ejemplo importante de esta clase de tinción fluorescente es la faloidina , que se utiliza para teñir fibras de actina en células de mamíferos . Un nuevo péptido, conocido como péptido hibridador de colágeno , también puede conjugarse con fluoróforos y usarse para teñir fibras de colágeno desnaturalizadas . La tinción de las paredes celulares de las plantas se realiza mediante tintes o colorantes que se unen a la celulosa o la pectina . La búsqueda de sondas fluorescentes con una alta especificidad que también permitan obtener imágenes en vivo de células vegetales está en curso. [7]
Hay muchas moléculas fluorescentes llamadas fluoróforos o fluorocromos , como la fluoresceína , Alexa Fluors o DyLight 488 , que pueden unirse químicamente a una molécula diferente que se une al objetivo de interés dentro de la muestra.
La inmunofluorescencia es una técnica que utiliza la unión altamente específica de un anticuerpo a su antígeno para marcar proteínas específicas u otras moléculas dentro de la célula. Se trata una muestra con un anticuerpo primario específico para la molécula de interés. Un fluoróforo se puede conjugar directamente con el anticuerpo primario. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo secundario , conjugado con un fluoróforo, que se una específicamente al primer anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo primario generado en un ratón que reconoce la tubulina combinado con un anticuerpo secundario anti-ratón derivatizado con un fluoróforo podría usarse para marcar microtúbulos en una célula. [ cita necesaria ]
La comprensión moderna de la genética y las técnicas disponibles para modificar el ADN permiten a los científicos modificar genéticamente proteínas para que también lleven una proteína indicadora fluorescente. En muestras biológicas, esto permite a un científico hacer directamente fluorescente una proteína de interés. Luego se puede rastrear directamente la ubicación de las proteínas, incluso en células vivas.
Los fluoróforos pierden su capacidad de emitir fluorescencia cuando se iluminan en un proceso llamado fotoblanqueo . El fotoblanqueo se produce cuando las moléculas fluorescentes acumulan daño químico de los electrones excitados durante la fluorescencia. El fotoblanqueo puede limitar gravemente el tiempo durante el cual se puede observar una muestra mediante microscopía de fluorescencia. Existen varias técnicas para reducir el fotoblanqueo, como el uso de fluoróforos más robustos, minimizando la iluminación o utilizando productos químicos fotoprotectores . [ cita necesaria ]
La microscopía de fluorescencia con proteínas indicadoras fluorescentes ha permitido el análisis de células vivas mediante microscopía de fluorescencia; sin embargo, las células son susceptibles a la fototoxicidad, particularmente con luz de longitud de onda corta. Además, las moléculas fluorescentes tienden a generar especies químicas reactivas cuando están bajo iluminación, lo que mejora el efecto fototóxico. [ cita necesaria ]
A diferencia de las técnicas de microscopía de luz transmitida y reflejada, la microscopía de fluorescencia sólo permite la observación de estructuras específicas que han sido marcadas para fluorescencia. Por ejemplo, observar una muestra de tejido preparada con una tinción de ADN fluorescente mediante microscopía de fluorescencia sólo revela la organización del ADN dentro de las células y no revela nada más sobre la morfología celular.
Las técnicas computacionales que proponen estimar la señal fluorescente a partir de imágenes no fluorescentes (como el campo claro) pueden reducir estas preocupaciones. [8] En general, estos enfoques implican entrenar una red neuronal convolucional profunda en células teñidas y luego estimar la fluorescencia en muestras no teñidas. Por lo tanto, al desacoplar las células bajo investigación de las células utilizadas para entrenar la red, las imágenes se pueden realizar más rápido y con una fototoxicidad reducida.
La naturaleza ondulatoria de la luz limita el tamaño del punto en el que se puede enfocar la luz debido al límite de difracción . Esta limitación fue descrita en el siglo XIX por Ernst Abbe y "limita la resolución de un microscopio óptico a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada". La microscopía de fluorescencia es fundamental para muchas técnicas que pretenden superar este límite mediante configuraciones ópticas especializadas. [ cita necesaria ]
En el siglo XX se inventaron varias mejoras en las técnicas de microscopía que han dado como resultado un aumento de la resolución y el contraste hasta cierto punto. Sin embargo, no superaron el límite de difracción. En 1978 se desarrollaron las primeras ideas teóricas para romper esta barrera mediante el uso de un microscopio 4Pi como microscopio de fluorescencia de barrido láser confocal donde la luz se enfoca idealmente desde todos los lados hacia un foco común que se utiliza para escanear el objeto "punto por punto". excitación "punto por punto" combinada con detección "punto por punto". [9] Sin embargo, la primera demostración experimental del microscopio 4pi tuvo lugar en 1994. [10] La microscopía 4Pi maximiza la cantidad de direcciones de enfoque disponibles mediante el uso de dos lentes objetivo opuestos o microscopía de excitación de dos fotones usando luz desplazada al rojo y excitación multifotónica. . [ cita necesaria ]
La microscopía correlativa integrada combina un microscopio de fluorescencia con un microscopio electrónico. Esto permite visualizar la ultraestructura y la información contextual con el microscopio electrónico mientras se utilizan los datos del microscopio de fluorescencia como herramienta de etiquetado. [11]
La primera técnica que realmente logró una resolución de subdifracción fue la microscopía STED , propuesta en 1994. Este método y todas las técnicas que siguen el concepto RESOLFT se basan en una fuerte interacción no lineal entre la luz y las moléculas fluorescentes. Las moléculas son impulsadas fuertemente entre estados moleculares distinguibles en cada ubicación específica, de modo que finalmente la luz puede emitirse sólo en una pequeña fracción del espacio y, por lo tanto, una mayor resolución.
También en la década de 1990 se desarrolló otro método de microscopía de súper resolución basado en la microscopía de campo amplio. Se logró una resolución de tamaño sustancialmente mejorada de nanoestructuras celulares teñidas con un marcador fluorescente mediante el desarrollo de la microscopía de localización SPDM y la iluminación láser estructurada (iluminación espacialmente modulada, SMI). [12] La combinación del principio de SPDM con SMI dio como resultado el desarrollo del microscopio Vertico SMI . [13] [14] La detección de una sola molécula de colorantes fluorescentes parpadeantes normales, como la proteína fluorescente verde (GFP), se puede lograr utilizando un desarrollo adicional de SPDM, la tecnología denominada SPDMphymod, que permite detectar y contar dos tipos diferentes de moléculas fluorescentes. a nivel molecular (esta tecnología se conoce como microscopía de localización de dos colores o 2CLM). [15]
Alternativamente, la llegada de la microscopía de localización fotoactivada podría lograr resultados similares basándose en el parpadeo o el cambio de moléculas individuales, donde la fracción de moléculas fluorescentes es muy pequeña en cada momento. Esta respuesta estocástica de las moléculas a la luz aplicada corresponde también a una interacción altamente no lineal, que conduce a una resolución de subdifracción.
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