La iluminación modulada espacialmente vertical ( Vertico-SMI ) es el microscopio óptico más rápido [ cita requerida ] para el análisis 3D de células completas en el rango nanométrico . Se basa en dos tecnologías desarrolladas en 1996, SMI (iluminación modulada espacialmente) y SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral). La resolución óptica efectiva de este nanoscopio óptico ha alcanzado las proximidades de 5 nm en 2D y 40 nm en 3D, superando ampliamente el límite de resolución λ/2 (alrededor de 200 nm para luz azul) que se aplica a la microscopía estándar que utiliza transmisión o reflexión de luz natural (a diferencia de la iluminación estructurada o fluorescencia ) de acuerdo con el límite de resolución de Abbe [1] Ese límite (también conocido como límite de Rayleigh ) había sido determinado por Ernst Abbe en 1873 y rige el límite de resolución alcanzable de los microscopios que utilizan técnicas convencionales.
El microscopio Vertico-SMI fue desarrollado por un equipo dirigido por Christoph Cremer , emérito [2] de la Universidad de Heidelberg , y se basa en la combinación de técnicas ópticas de luz de microscopía de localización (SPDM, microscopía de distancia de precisión espectral ) e iluminación estructurada (SMI, iluminación espacialmente modulada ).
Desde marzo de 2008, muchos colorantes fluorescentes estándar como GFP y colorantes fluorescentes Alexa se pueden utilizar con esta microscopía de localización denominada SPDMphymod (fluoróforos físicamente modificables), para la que sólo una única longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la nanoimagen.
SMI representa un tipo especial de iluminación óptica láser ( iluminación modulada espacialmente ) y Vertico refleja la disposición vertical del eje del microscopio que hace posible el análisis de células fijas , pero también de células vivas con una resolución óptica inferior a 10 nanómetros (1 nanómetro = 1 nm = 1 × 10 −9 m).
Una particularidad de esta tecnología en comparación con las técnicas de enfoque como la microscopía 4Pi es la exposición de campo amplio que permite representar células enteras a escala nanométrica. Una exposición tridimensional de una célula entera con un tamaño de objeto típico de 20 µm × 20 µm requiere solo 2 minutos. La exposición de campo amplio significa que todo el objeto se ilumina y se detecta simultáneamente.
La microscopía SMI es un proceso óptico de luz de la denominada ingeniería de funciones de dispersión de puntos . Se trata de procesos que modifican la función de dispersión de puntos (PSF) de un microscopio de forma adecuada para aumentar la resolución óptica, maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes que son pequeños en relación con la longitud de onda de la luz que los ilumina o extraer otros parámetros estructurales en el rango nanométrico.
El microscopio SMI que se está desarrollando en el Instituto Kirchhoff de Física de la Universidad de Heidelberg logra esto de la siguiente manera: la intensidad de la iluminación dentro del rango del objeto no es uniforme, a diferencia de los microscopios de fluorescencia de campo amplio convencionales, sino que se modula espacialmente de manera precisa mediante el uso de dos rayos láser opuestos que interfieren a lo largo del eje. El principio del campo de onda modulado espacialmente fue desarrollado en 1993 por Bailey et al. El enfoque de microscopía SMI utilizado en la aplicación de Heidelberg mueve el objeto en pasos de alta precisión a través del campo de onda, o el campo de onda en sí se mueve en relación con el objeto por cambio de fase. Esto da como resultado una resolución de distancia y tamaño axial mejorada. [3] [4]
La SMI se puede combinar con otras tecnologías de súper resolución, por ejemplo, con 3D LIMON o LSI- TIRF como un interferómetro de reflexión interna total con iluminación estructurada lateralmente. Esta técnica de SMI permitió adquirir imágenes ópticas de distribuciones de autofluoróforos en secciones de tejido ocular humano con una resolución óptica sin precedentes. El uso de tres longitudes de onda de excitación diferentes (488, 568 y 647 nm) permite recopilar información espectral sobre la señal de autofluorescencia. Esto se ha utilizado para el tejido ocular humano afectado por degeneración macular (DMAE). [5]
Una única y diminuta fuente de luz se puede localizar mucho mejor que la resolución de un microscopio: aunque la luz producirá un punto borroso, se pueden utilizar algoritmos informáticos para calcular con precisión el centro del punto borroso, teniendo en cuenta la función de dispersión de puntos del microscopio, las propiedades de ruido del detector, etc. Sin embargo, este enfoque no funciona cuando hay demasiadas fuentes cercanas entre sí: todas las fuentes se difuminan juntas.
SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral) es una familia de técnicas en microscopía de fluorescencia que soluciona este problema midiendo solo unas pocas fuentes a la vez, de modo que cada fuente esté "ópticamente aislada" de las demás (es decir, separadas por más de la resolución del microscopio, típicamente ~200-250 nm). [6] [7] [8] Luego, se puede utilizar la técnica anterior (encontrar el centro de cada punto borroso).
Si las moléculas tienen una variedad de espectros diferentes (espectros de absorción y/o espectros de emisión), entonces es posible observar la luz de sólo unas pocas moléculas a la vez utilizando las fuentes de luz y los filtros adecuados. Las moléculas también se pueden distinguir de formas más sutiles en función del tiempo de vida de la fluorescencia y otras técnicas. [6]
La resolución estructural alcanzable mediante SPDM se puede expresar en términos de la distancia medible más pequeña entre dos partículas puntiformes determinadas en su posición espacial con diferentes características espectrales ("resolución topológica"). La modelización ha demostrado que, en condiciones adecuadas en cuanto a precisión de localización, densidad de partículas, etc., la "resolución topológica" corresponde a una " frecuencia espacial " que, en términos de la definición clásica, equivale a una resolución óptica muy mejorada.
SPDM es un microscopio de localización que logra una resolución óptica efectiva varias veces mejor que la resolución óptica convencional (aprox. 200-250 nm), representada por la mitad del ancho del máximo principal de la función de imagen puntual efectiva. Mediante la aplicación de procesos de precisión óptica láser adecuados, se pueden medir posiciones y distancias significativamente menores que la mitad del ancho de la función de dispersión de puntos (convencionalmente 200-250 nm) con precisión nanométrica entre objetivos con diferentes firmas espectrales. [6] Un área de aplicación importante es la investigación del genoma (estudio de la organización funcional del genoma ). Otra área de uso importante es la investigación de la estructura de las membranas.
Uno de los fundamentos más importantes de la microscopía de localización en general es el primer trabajo experimental para la localización de objetos fluorescentes en la nanoescala (3D) en 1996 [9] y la prueba teórica y experimental de una precisión de localización utilizando luz visible en el rango de 1 nm – la base para la microscopía de localización mejor que 1/100 de la longitud de onda. [10] [11]
En los últimos dos años, se han utilizado en los estudios nanoscópicos moléculas que emiten la misma frecuencia espectral de luz (pero con diferentes firmas espectrales en función de las características de destello), pero que pueden encenderse y apagarse mediante luz, tal como es necesario para la microscopía de distancia de precisión espectral. Al combinar miles de imágenes de la misma célula, fue posible, mediante mediciones de precisión óptica láser, registrar imágenes de localización con una resolución óptica significativamente mejorada. La aplicación de estos nuevos procesos de nanoscopía parecía hasta hace poco muy difícil porque se suponía que solo las moléculas especialmente fabricadas podían encenderse y apagarse de manera adecuada mediante el uso de luz.
En marzo de 2008, el laboratorio de Christoph Cremer descubrió que esto también era posible para muchos colorantes fluorescentes estándar como GFP , colorantes Alexa y moléculas de fluoresceína, siempre que se dieran ciertas condiciones fotofísicas. Con esta tecnología denominada SPDMphymod (fluoróforos físicamente modificables), una única longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la obtención de imágenes nanométricas. En cambio, otras microscopías de localización necesitan dos longitudes de onda láser cuando se utilizan moléculas de fluorescencia especiales fotoconmutables/fotoactivables. [12]
El gen GFP se ha introducido y expresado en muchas células procariotas y eucariotas y el Premio Nobel de Química de 2008 fue otorgado a Martin Chalfie , Osamu Shimomura y Roger Y. Tsien por su descubrimiento y desarrollo de la proteína fluorescente verde. El hallazgo de que estas moléculas fluorescentes estándar se pueden utilizar amplía la aplicabilidad del método SPMD a numerosos campos de investigación en biofísica , biología celular y medicina .
Colorantes fluorescentes estándar ya utilizados con éxito con la tecnología SPDMphymod: GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 y fluoresceína.
LIMON (Light Microscopical Nanosizing Microscopy) fue inventado en 2001 en la Universidad de Heidelberg y combina la microscopía de localización y la iluminación modulada espacialmente con la microscopía de súper resolución 3D.
Las imágenes 3D que se obtienen con Vertico-SMI son posibles gracias a la combinación de SMI y SPDM, en la que primero se aplica el proceso SMI y luego el SPDM. El proceso SMI determina el centro de las partículas y su dispersión en la dirección del eje del microscopio. Mientras que el centro de las partículas/moléculas se puede determinar con una precisión de 1-2 nm, la dispersión alrededor de este punto se puede determinar hasta un diámetro axial de aproximadamente 30-40 nm.
Posteriormente, se determina la posición lateral de las partículas/moléculas individuales utilizando SPDM, logrando una precisión de unos pocos nanómetros. En la actualidad, SPDM logra 16 cuadros/seg con una resolución efectiva de 10 nm en 2D (plano del objeto); aproximadamente 2000 de estos cuadros se combinan con datos SMI (tiempo de adquisición de aprox. 10 s) para lograr una imagen tridimensional de máxima resolución (resolución óptica 3D efectiva de aprox. 40-50 nm). Con una cámara más rápida , se pueden esperar velocidades aún mayores (hasta varios cientos de cuadros/seg, en desarrollo). Usando colorantes adecuados, deberían ser posibles resoluciones ópticas 3D efectivas aún mayores [13].
Mediante la combinación de SPDMphymod con SMI (ambos inventados en el laboratorio de Christoph Cremer en 1996) se logró una reconstrucción tridimensional en dos colores de las disposiciones espaciales de los grupos de Her2/neu y Her3. Las posiciones en las tres direcciones de los grupos de proteínas se pudieron determinar con una precisión de aproximadamente 25 nm. [14]
A pesar de su uso en laboratorios biomédicos, las tecnologías de superresolución podrían servir como herramientas importantes en la investigación farmacéutica. Podrían ser especialmente útiles en la identificación y valoración de objetivos. Por ejemplo, las máquinas biomoleculares (BMM) son nanoestructuras altamente complejas que consisten en varias moléculas grandes y que son responsables de funciones básicas en las células del cuerpo. Dependiendo de su estado funcional, tienen una estructura 3D definida. Ejemplos de máquinas biomoleculares son los nucleosomas que permiten que el ADN, un portador de información genética de dos metros de largo, se pliegue en las células del cuerpo en un espacio de solo unas millonésimas de milímetro de diámetro. Por lo tanto, el ADN puede servir como un centro de información y control.
Mediante el uso de LIMON 3D en combinación con el marcaje de complejos LIMON, es posible por primera vez hacer visibles las proteínas o los ácidos nucleicos ocultos de un complejo de moléculas 3D de las llamadas máquinas biomoleculares sin destruir el complejo. Hasta ahora, el problema en la mayoría de los casos era que el complejo tenía que destruirse para el análisis detallado de las macromoléculas individuales que lo componen. Alternativamente, se utilizaban modelos de simulación por ordenador virtuales o métodos costosos de resonancia magnética nuclear para visualizar la estructura tridimensional de dichos complejos. [15]
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