Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza fluorescencia en lugar de, o además de, dispersión , reflexión y atenuación o absorción , para estudiar las propiedades de sustancias orgánicas o inorgánicas . [1] [2] "Microscopio de fluorescencia" se refiere a cualquier microscopio que utiliza fluorescencia para generar una imagen, ya sea una configuración simple como un microscopio de epifluorescencia o un diseño más complicado como un microscopio confocal , que utiliza seccionamiento óptico para obtener una mejor resolución de la imagen de fluorescencia. [3]
La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica (o longitudes de onda) que es absorbida por los fluoróforos , lo que hace que emitan luz de longitudes de onda más largas (es decir, de un color diferente al de la luz absorbida). La luz de iluminación se separa de la fluorescencia emitida, mucho más débil, mediante el uso de un filtro de emisión espectral. Los componentes típicos de un microscopio de fluorescencia son una fuente de luz ( la lámpara de arco de xenón o la lámpara de vapor de mercurio son comunes; las formas más avanzadas son los LED y láseres de alta potencia ), el filtro de excitación , el espejo dicroico (o divisor de haz dicroico ) y el filtro de emisión (consulte la figura siguiente). Los filtros y el divisor de haz dicroico se eligen para que coincidan con las características espectrales de excitación y emisión del fluoróforo utilizado para etiquetar la muestra. [1] De esta manera, se obtiene la imagen de la distribución de un solo fluoróforo (color) a la vez. Las imágenes multicolor de varios tipos de fluoróforos deben componerse combinando varias imágenes de un solo color. [1]
La mayoría de los microscopios de fluorescencia que se utilizan son microscopios de epifluorescencia, en los que la excitación del fluoróforo y la detección de la fluorescencia se realizan a través de la misma trayectoria de luz (es decir, a través del objetivo). Estos microscopios se utilizan ampliamente en biología y son la base de diseños de microscopios más avanzados, como el microscopio confocal y el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF).
La mayoría de los microscopios de fluorescencia, especialmente los utilizados en las ciencias de la vida , son del diseño de epifluorescencia que se muestra en el diagrama. La luz de la longitud de onda de excitación ilumina la muestra a través de la lente del objetivo . La fluorescencia emitida por la muestra se enfoca hacia el detector mediante el mismo objetivo que se utiliza para la excitación, que para una mayor resolución necesitará una lente objetivo con una apertura numérica más alta . Dado que la mayor parte de la luz de excitación se transmite a través de la muestra, solo la luz excitatoria reflejada llega al objetivo junto con la luz emitida y, por lo tanto, el método de epifluorescencia proporciona una alta relación señal-ruido. El divisor de haz dicroico actúa como un filtro específico de longitud de onda, transmitiendo la luz fluorescente a través del ocular o detector, pero reflejando cualquier luz de excitación restante de regreso hacia la fuente. [ cita requerida ]
La microscopía de fluorescencia requiere una iluminación intensa, casi monocromática, que algunas fuentes de luz generalizadas, como las lámparas halógenas , no pueden proporcionar. [4] Se utilizan cuatro tipos principales de fuentes de luz, incluidas las lámparas de arco de xenón o las lámparas de vapor de mercurio con un filtro de excitación , los láseres , las fuentes supercontinuas y los LED de alta potencia . Los láseres son los más utilizados para técnicas de microscopía de fluorescencia más complejas, como la microscopía confocal y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, mientras que las lámparas de xenón, las lámparas de mercurio y los LED con un filtro de excitación dicroico se utilizan comúnmente para microscopios de epifluorescencia de campo amplio. Al colocar dos conjuntos de microlentes en la trayectoria de iluminación de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio, [5] se puede lograr una iluminación altamente uniforme con un coeficiente de variación del 1-2%.
Para que una muestra sea adecuada para la microscopía de fluorescencia, debe ser fluorescente. Existen varios métodos para crear una muestra fluorescente; las técnicas principales son el marcaje con tinciones fluorescentes o, en el caso de muestras biológicas, la expresión de una proteína fluorescente . Alternativamente, se puede utilizar la fluorescencia intrínseca de una muestra (es decir, autofluorescencia ). [1] En las ciencias de la vida, la microscopía de fluorescencia es una herramienta poderosa que permite la tinción específica y sensible de una muestra para detectar la distribución de proteínas u otras moléculas de interés. Como resultado, existe una amplia gama de técnicas para la tinción fluorescente de muestras biológicas. [ cita requerida ]
Se han diseñado muchas tinciones fluorescentes para una variedad de moléculas biológicas. Algunas de ellas son moléculas pequeñas que son intrínsecamente fluorescentes y se unen a una molécula biológica de interés. Los principales ejemplos de estas son las tinciones de ácidos nucleicos como DAPI y Hoechst (excitadas por luz de longitud de onda UV) y DRAQ5 y DRAQ7 (excitadas óptimamente por luz roja), que se unen al surco menor del ADN , marcando así los núcleos de las células. Otras son fármacos, toxinas o péptidos que se unen a estructuras celulares específicas y se han derivado con un reportero fluorescente. Un ejemplo importante de esta clase de tinción fluorescente es la faloidina , que se utiliza para teñir fibras de actina en células de mamíferos . Un nuevo péptido, conocido como péptido hibridizante de colágeno , también se puede conjugar con fluoróforos y utilizar para teñir fibras de colágeno desnaturalizadas . La tinción de las paredes celulares de las plantas se realiza utilizando tinciones o colorantes que se unen a la celulosa o la pectina . La búsqueda de sondas fluorescentes con una alta especificidad que también permitan obtener imágenes en vivo de células vegetales continúa. [7]
Hay muchas moléculas fluorescentes llamadas fluoróforos o fluorocromos, como la fluoresceína , Alexa Fluors o DyLight 488 , que pueden unirse químicamente a una molécula diferente que se une al objetivo de interés dentro de la muestra.
La inmunofluorescencia es una técnica que utiliza la unión altamente específica de un anticuerpo a su antígeno para marcar proteínas específicas u otras moléculas dentro de la célula. Una muestra se trata con un anticuerpo primario específico para la molécula de interés. Un fluoróforo se puede conjugar directamente con el anticuerpo primario. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo secundario , conjugado con un fluoróforo, que se une específicamente al primer anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo primario generado en un ratón que reconoce la tubulina combinado con un anticuerpo secundario antirratón derivado con un fluoróforo se podría utilizar para marcar los microtúbulos en una célula. [ cita requerida ]
La comprensión moderna de la genética y las técnicas disponibles para modificar el ADN permiten a los científicos modificar genéticamente las proteínas para que también contengan un marcador fluorescente. En muestras biológicas, esto permite a un científico hacer que una proteína de interés sea fluorescente directamente. La ubicación de la proteína puede rastrearse directamente, incluso en células vivas.
Los fluoróforos pierden su capacidad de fluorescencia cuando se iluminan en un proceso llamado fotoblanqueo . El fotoblanqueo ocurre cuando las moléculas fluorescentes acumulan daño químico de los electrones excitados durante la fluorescencia. El fotoblanqueo puede limitar severamente el tiempo durante el cual una muestra puede ser observada por microscopía de fluorescencia. Existen varias técnicas para reducir el fotoblanqueo, como el uso de fluoróforos más robustos, minimizando la iluminación o utilizando químicos depuradores fotoprotectores . [ cita requerida ]
La microscopía de fluorescencia con proteínas fluorescentes ha permitido el análisis de células vivas mediante microscopía de fluorescencia; sin embargo, las células son susceptibles a la fototoxicidad, en particular con luz de longitud de onda corta. Además, las moléculas fluorescentes tienen una tendencia a generar especies químicas reactivas cuando se encuentran bajo iluminación, lo que aumenta el efecto fototóxico. [ cita requerida ]
A diferencia de las técnicas de microscopía de luz reflejada y transmitida, la microscopía de fluorescencia solo permite la observación de las estructuras específicas que han sido marcadas para fluorescencia. Por ejemplo, observar una muestra de tejido preparada con una tinción de ADN fluorescente mediante microscopía de fluorescencia solo revela la organización del ADN dentro de las células y no revela nada más sobre las morfologías celulares.
Las técnicas computacionales que proponen estimar la señal fluorescente a partir de imágenes no fluorescentes (como las de campo claro) pueden reducir estas preocupaciones. [8] En general, estos enfoques implican entrenar una red neuronal convolucional profunda en células teñidas y luego estimar la fluorescencia en muestras no teñidas. Por lo tanto, al disociar las células bajo investigación de las células utilizadas para entrenar la red, la obtención de imágenes se puede realizar más rápido y con fototoxicidad reducida.
La naturaleza ondulatoria de la luz limita el tamaño del punto en el que se puede enfocar la luz debido al límite de difracción . Esta limitación fue descrita en el siglo XIX por Ernst Abbe y "limita la resolución de un microscopio óptico a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada". La microscopía de fluorescencia es fundamental para muchas técnicas que apuntan a superar este límite mediante configuraciones ópticas especializadas. [ cita requerida ]
En el siglo XX se han inventado varias mejoras en las técnicas de microscopía que han dado como resultado un aumento de la resolución y el contraste en cierta medida. Sin embargo, no superaron el límite de difracción. En 1978 se desarrollaron las primeras ideas teóricas para romper esta barrera utilizando un microscopio 4Pi como microscopio de fluorescencia de barrido láser confocal donde la luz se enfoca idealmente desde todos los lados hacia un foco común que se utiliza para escanear el objeto mediante excitación "punto por punto" combinada con detección "punto por punto". [9] Sin embargo, la primera demostración experimental del microscopio 4pi tuvo lugar en 1994. [10] La microscopía 4Pi maximiza la cantidad de direcciones de enfoque disponibles utilizando dos lentes objetivo opuestas o microscopía de excitación de dos fotones utilizando luz desplazada al rojo y excitación multifotón. [ cita requerida ]
La microscopía correlativa integrada combina un microscopio de fluorescencia con un microscopio electrónico. Esto permite visualizar la ultraestructura y la información contextual con el microscopio electrónico mientras se utilizan los datos del microscopio de fluorescencia como herramienta de etiquetado. [11]
La primera técnica que realmente logró una resolución inferior a la difracción fue la microscopía STED , propuesta en 1994. Este método y todas las técnicas que siguen el concepto RESOLFT se basan en una fuerte interacción no lineal entre la luz y las moléculas fluorescentes. Las moléculas se mueven fuertemente entre estados moleculares distinguibles en cada ubicación específica, de modo que finalmente la luz puede emitirse en solo una pequeña fracción del espacio, lo que da como resultado una mayor resolución.
También en la década de 1990 se desarrolló otro método de microscopía de súper resolución basado en la microscopía de campo amplio. Se logró una resolución de tamaño sustancialmente mejorada de las nanoestructuras celulares teñidas con un marcador fluorescente mediante el desarrollo de la microscopía de localización SPDM y la iluminación láser estructurada (iluminación modulada espacialmente, SMI). [12] La combinación del principio de SPDM con SMI dio como resultado el desarrollo del microscopio Vertico SMI . [13] [14] La detección de moléculas individuales de colorantes fluorescentes parpadeantes normales como la proteína fluorescente verde (GFP) se puede lograr utilizando un desarrollo posterior de SPDM, la llamada tecnología SPDMphymod, que hace posible detectar y contar dos tipos diferentes de moléculas fluorescentes a nivel molecular (esta tecnología se conoce como microscopía de localización de dos colores o 2CLM). [15]
Alternativamente, la aparición de la microscopía de localización fotoactivada podría lograr resultados similares al basarse en el parpadeo o el cambio de moléculas individuales, donde la fracción de moléculas fluorescentes es muy pequeña en cada momento. Esta respuesta estocástica de las moléculas a la luz aplicada corresponde también a una interacción altamente no lineal, lo que conduce a una resolución de subdifracción.
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