El nitrógeno asimilable por levaduras o YAN es la combinación de nitrógeno amino libre (FAN), amoníaco (NH 3 ) y amonio (NH 4 + ) que está disponible para una levadura, por ejemplo, la levadura de vino Saccharomyces cerevisiae , para utilizar durante la fermentación . Fuera de los azúcares fermentables glucosa y fructosa , el nitrógeno es el nutriente más importante necesario para llevar a cabo una fermentación exitosa que no finalice antes del punto de sequedad deseado o que no produzca olores desagradables y fallas relacionadas con el vino . En este sentido, los enólogos a menudo complementarán los recursos de YAN disponibles con aditivos de nitrógeno como el fosfato diamónico (DAP). [1]
Sin embargo, la adición de cantidades excesivas de nitrógeno también puede crear un peligro, ya que otros organismos además de la levadura beneficiosa del vino pueden utilizar los nutrientes. Estos incluyen organismos de descomposición como Brettanomyces , Acetobacter y bacterias de ácido láctico de los géneros Lactobacillus y Pediococcus . Es por eso que muchas bodegas medirán el YAN después de la cosecha y el estrujado utilizando uno de los varios métodos disponibles en la actualidad, incluido el nitrógeno por ensayo de o-ftaldialdehído (NOPA), que requiere el uso de un espectrómetro o el método de titulación de Formol . Conocer el YAN en el mosto permite a los enólogos calcular la cantidad correcta de aditivo necesario para atravesar la fermentación, dejando solo un "desierto de nutrientes" para cualquier organismo de descomposición que aparezca después. [2]
La cantidad de YAN que los productores de vino verán en sus mostos de uva depende de una serie de componentes, entre ellos la variedad de uva , el portainjerto , los suelos del viñedo y las prácticas vitícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo del dosel ), así como las condiciones climáticas de cosechas particulares . [3]
El YAN es una medida de las fuentes primarias orgánicas (aminoácidos libres) e inorgánicas (amoniaco y amonio) de nitrógeno que pueden ser asimiladas por S. cerevisiae . Hay varios compuestos nitrogenados que se encuentran en el mosto y el vino, incluidos péptidos , proteínas más grandes , amidas , aminas biógenas , piridinas , purinas y ácidos nucleicos , pero estos no pueden ser utilizados directamente por la levadura para el metabolismo. En conjunto, el contenido total de nitrógeno del mosto de uva puede variar de 60 a 2400 mg de nitrógeno por litro, sin embargo, no todo este nitrógeno será asimilable. [1] La falta de enzimas proteasas , que descomponen los péptidos más grandes en componentes más pequeños, que pueden funcionar fuera de la célula, limita el tamaño de las moléculas que la levadura puede usar como fuente de nitrógeno. [3] [4]
La cantidad de YAN que los productores de vino verán en sus mostos de uva depende de una serie de componentes, entre ellos la variedad de uva, el portainjerto, los suelos del viñedo y las prácticas vitivinícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo del follaje), así como las condiciones climáticas de cosechas particulares. Las infecciones por moho, como Botrytis cinerea (conocida como podredumbre noble cuando se desea) pueden reducir el contenido de aminoácidos del mosto de uva hasta en un 61%. [1] Algunas regiones se destacan por tener un YAN bajo, como el estado de Washington , que durante una cosecha típica tendrá el 90% del mosto analizado por debajo de 400 mg N/L [5] y casi una cuarta parte estará por debajo de 150 mg N/L. [2]
En el viñedo, el nitrógeno es absorbido por la vid en forma de nitrato (NO 3 − ), amonio o urea , que se reduce a amoniaco. A través de reacciones adicionales, el nitrógeno se incorpora a la glutamina y al glutamato y, finalmente, se utiliza en la síntesis de otros aminoácidos y compuestos nitrogenados. [1] Después de la cosecha, la mayoría (alrededor del 80 %) de los compuestos nitrogenados disponibles que se encuentran en las uvas se concentran en los hollejos y las semillas. Estos compuestos se liberan en el mosto durante el proceso de trituración y durante la maceración /contacto con los hollejos. [4] Incluso después del prensado, hasta el 80 % del contenido inicial de nitrógeno dentro de cada uva quedará en el orujo . [3]
Del nitrógeno amino libre (FAN) que compone el YAN, los aminoácidos arginina , prolina y glutamina son los más abundantes, seguidos de alanina , treonina , serina y ácido aspártico en concentraciones mucho más pequeñas [1] aunque se pueden encontrar trazas de la mayoría de los aminoácidos conocidos en el mosto de uva. [2] La prolina suele ser la más concentrada y puede representar hasta el 30% de la cantidad total de aminoácidos. [4] La cantidad exacta de FAN variará y puede oscilar entre 22 y 1242 mg de nitrógeno/litro de YAN derivado de aminoácidos libres. [5]
Mientras que la arginina, la glutamina y otros aminoácidos se consumen rápidamente, a menudo al principio de la fermentación, la prolina no es consumida por la levadura en absoluto durante las condiciones anaeróbicas normales de las fermentaciones. Esto se debe a que una de las enzimas necesarias para su uso es una oxidasa (que requiere oxígeno molecular) y la otra es reprimida por la presencia de amonio (otra fuente de nitrógeno asimilable que necesita la levadura) en el mosto. Sin embargo, los cultivos iniciadores bien aireados que contienen mosto al que no se le ha añadido fosfato diamónico suelen ver cierta utilización de prolina antes de que entren en juego las condiciones anaeróbicas de la fermentación. [1] Cuando los enólogos miden el FAN, deben saber si su ensayo incluye prolina, ya que esto hará que su medición de YAN sea más alta. Chardonnay y Cabernet Sauvignon son dos variedades de Vitis vinifera que se sabe que tienen niveles muy altos de prolina, mientras que Riesling y Sauvignon blanc suelen tener niveles muy bajos. [4]
La levadura transporta aminoácidos y péptidos pequeños (menos de 5 residuos de aminoácidos ) a la célula mediante un proceso de transporte activo que utiliza proteínas de membrana especializadas y la diferencia en el gradiente de pH de la solución ácida del vino (pH entre 3-4) y el pH casi neutro del citoplasma dentro de las células de levadura. Las proteínas simportadoras de protones en la membrana absorben el aminoácido junto con un ion hidrógeno que luego es expulsado por la célula a través de una bomba de iones hidrógeno . Este es un proceso dependiente de la energía que se vuelve energéticamente más desfavorable para la célula de levadura a medida que avanza la fermentación y aumentan los niveles de etanol, lo que crea una "fuga pasiva" de iones hidrógeno en exceso hacia la célula. Las bombas de iones hidrógeno de la célula tienen que trabajar aún más para mantener su pH interno, por lo que envían una señal a las proteínas simportadoras para que dejen de traer otros iones. Esta es una de las razones por las que las adiciones tardías de nitrógeno a la fermentación tienen poca o ninguna efectividad, ya que los mecanismos de transporte del nitrógeno hacia la célula se detienen. [4]
Durante la fermentación, el amonio es la principal forma de nitrógeno asimilable disponible para la levadura. [1] Sin embargo, al triturar el jugo puede contener entre 0 y 150 mg/L de sales de amonio, dependiendo de la cantidad de nitrógeno que haya recibido la vid en el viñedo. [4]
En la célula, el amoníaco inorgánico y los iones de amonio se "fijan" a través de una serie de reacciones químicas que finalmente producen glutamato, una fuente de nitrógeno orgánico. [2] El ion amonio también actúa como regulador alostérico de una de las enzimas utilizadas en la glucólisis y también puede tener un efecto sobre la forma en que la célula de levadura transporta glucosa y fructosa al interior de la célula. [4] Se ha demostrado que las proteínas utilizadas en el sistema principal de transporte de glucosa tienen una vida media de 12 horas. En los estudios en los que se sometió a las células de levadura a una "inanición de amoníaco", todo el sistema se apagó después de 50 horas, lo que proporciona una fuerte evidencia de que la falta de amoníaco/amonio puede generar un mayor riesgo de que se produzca una fermentación estancada. [3]
El glutatión (GSH: L-gamma-glutamil-L-cisteinilglicina) está presente en altas concentraciones de hasta 10 mM en las células de levadura y cumple una función fundamental en la respuesta a la carencia de azufre y nitrógeno. [6]
El amoniaco no es utilizado por bacterias como Acetobacter y las bacterias del ácido láctico utilizadas en la fermentación maloláctica . [2]
El nitrógeno asimilable es un nutriente esencial que la levadura del vino necesita para completar la fermentación con una cantidad mínima de subproductos indeseables (como compuestos como el sulfuro de hidrógeno que pueden generar olores desagradables). Durante el transcurso de una fermentación, la levadura puede utilizar hasta 1000 mg/L de aminoácidos, aunque a menudo se necesita una cantidad mucho menor. [2] La levadura puede almacenar aminoácidos en vacuolas intracelulares y luego utilizarlos directamente, incorporándolos a las proteínas, o descomponerlos y utilizar sus componentes de carbono y nitrógeno por separado. [4]
En ausencia de nitrógeno, la levadura comenzará a apagarse y morir. Algunas cepas comenzarán a descomponer aminoácidos que contienen azufre, como la cisteína y la metionina, liberando un átomo de azufre que puede combinarse con hidrógeno para producir sulfuro de hidrógeno ( H
2S ) que puede impartir olores a huevo podrido al vino. Sin embargo, no existe una correlación directa entre los niveles de YAN y la producción de sulfuro de hidrógeno, ya que la levadura puede producir H 2 S incluso en presencia de nitrógeno abundante pero con otros nutrientes vitales (como la vitamina ácido pantoténico ) faltantes. Incluso hay algunas cepas de S. cerevisiae que producen H 2 S como respuesta a tener demasiado nitrógeno disponible (en particular demasiado ácido glutámico y alanina [3] ). Es por eso que un enfoque profiláctico de agregar indiscriminadamente suplementos de nitrógeno a cada fermentación puede no tener los resultados deseados de prevenir el H 2 S. [2]
Los niveles de nitrógeno en el vino pueden influir en muchos aspectos sensoriales del vino resultante, incluida la síntesis de muchos compuestos aromáticos. Los alcoholes fusel se forman por degradación de aminoácidos, aunque en presencia de altos niveles de amoníaco y urea su producción se reduce. Cuando el nitrógeno disponible es limitado, los niveles de glicerol y trehalosa , que pueden influir en la sensación en boca , son más altos. [3]
La cantidad de YAN necesaria dependerá de los objetivos del enólogo para la fermentación, en particular si se desea o no una fermentación salvaje o si el vino se fermentará completamente hasta secarse. El estado de las uvas y las condiciones de fermentación influirán en la cantidad de nitrógeno necesaria. La fruta dañada, mohosa o infectada por botrytis generalmente tendrá menos nitrógeno (así como otros recursos vitamínicos) cuando llegue del viñedo que las uvas limpias e intactas. Esta disminución puede verse exacerbada aún más por una clarificación excesiva del mosto y un alto contenido de azúcar. Los vinos fermentados a temperaturas más altas tienden a progresar a un ritmo más rápido, requiriendo más nitrógeno que una fermentación más larga y más fría. Además, la cantidad de exposición al oxígeno influirá en la tasa de absorción de nitrógeno por parte de la levadura, ya que el vino fermentado en condiciones anaeróbicas completas (como muchos vinos blancos en tanques de acero inoxidable) requiere menos nitrógeno que los vinos fermentados en barriles o fermentadores abiertos. [7]
El rango sugerido por los enólogos varía de 150 mg/L de YAN [8] a 400 mg de nitrógeno por litro. [9] Algunos estudios han demostrado que se pueden lograr tasas de fermentación máximas con YAN en el rango de 400 a 500 mg N/L. [10] Sin embargo, no todos los enólogos querrán tener una fermentación a la velocidad máxima (en términos de biomasa de levadura, temperatura y velocidad) debido al impacto que puede tener en otros aspectos sensoriales del vino, como el desarrollo del aroma y la retención de la fruta. [3]
Un estudio del Departamento de Viticultura y Enología de la Universidad de California en Davis concluyó que se pueden hacer recomendaciones sobre los niveles óptimos de nitrógeno para completar una fermentación exitosa en función del nivel de brix de la cosecha , que han sido adoptados por muchos fabricantes de levaduras y nutrientes. [11] [12]
Sin embargo, otros estudios han demostrado que se puede llevar a cabo una fermentación exitosa con niveles de YAN por debajo de estas recomendaciones, así como fermentaciones lentas o estancadas incluso cuando los niveles de YAN están en línea con las recomendaciones. [1]
Al igual que la levadura, las bacterias del ácido láctico (BAL) utilizadas en la fermentación maloláctica (generalmente Oenococcus oeni ) requieren nitrógeno. Sin embargo, a diferencia de S. cerevisiae, las BAL no pueden utilizar amoníaco y los aditivos como el fosfato diamónico (DAP) no ofrecen beneficios nutricionales. Los productores de vino que utilizan inadvertidamente el DAP como aditivo nutricional para su inoculación de FML corren el riesgo de proporcionar nutrientes en su lugar a organismos causantes de descomposición como Brettanomyces . [2]
Si bien algunos productores de vino inoculan sus bacterias lácticas con nutrientes que incluyen nitrógeno, la mayoría de los nutrientes necesarios para la fermentación maloláctica provienen de la descomposición (o autólisis ) de las células de levadura muertas. Además, la mayoría de las bacterias utilizadas en la fermentación maloláctica tienen la capacidad de producir enzimas proteasas extracelulares que también pueden descomponer cadenas de péptidos más grandes en sus residuos de aminoácidos básicos que luego pueden usarse para el metabolismo. [4]
El ensayo de nitrógeno por o-ftaldialdehído (NOPA) se utiliza para medir los aminoácidos primarios disponibles en el jugo de uva utilizando un espectrofotómetro que puede medir longitudes de onda de 335 nm . Dado que el ensayo solo mide aminoácidos primarios, los resultados producidos no incluirán concentraciones de prolina o amoníaco. [13] La prolina se puede medir por separado con un ensayo que utiliza ninhidrina para reaccionar con el aminoácido en presencia de ácido fórmico , lo que produce un compuesto que puede absorberse a 517 nm. [1]
La titulación con formol , inventada por el químico danés SPL Sørensen en 1907, utiliza formaldehído en presencia de hidróxido de potasio o sodio para medir la concentración de aminoácidos y amoníaco con la ayuda de un medidor de pH . Los reactivos también reaccionarán con prolina, lo que puede dar una medición de YAN ligeramente más alta que la de NOPA. [14] El método formal también tiene las desventajas de implicar el uso y la eliminación de formaldehído, que es un carcinógeno conocido [15] y el reactivo altamente tóxico cloruro de bario . [1]
El amoníaco y el amonio se pueden medir utilizando una sonda de electrodo selectivo de iones y un medidor de pH. [1]
Los productores de vino saben desde hace mucho tiempo que algunas fermentaciones son más predecibles y "saludables" si se añade al lote el orujo (los hollejos sólidos, las semillas y los restos que quedan después del prensado ) de otro vino. Este es un método que todavía se utiliza hoy en día para elaborar el vino italiano Ripasso . En la Toscana del siglo XIV , la técnica del governoro utilizada en algunos de los primeros Chiantis implicaba añadir uvas secas al lote. [16] Aunque eso también añadía azúcar, ambos métodos proporcionaban nitrógeno adicional y otros nutrientes que todavía estaban disponibles en los hollejos y las semillas. [17]
A medida que los enólogos comenzaron a comprender mejor la ciencia de la fermentación, se identificó al nitrógeno como un nutriente principal y los productores de vino, ya en la década de 1900, comenzaron a agregar sales de amonio a su mosto. [4] La urea también se utilizó como un suplemento de nitrógeno temprano, pero la investigación que la vincula con el desarrollo del carbamato de etilo ha llevado a su prohibición en muchos países, incluido Estados Unidos desde 1990. [2] [18] [19]
Existen muchos tipos de suplementos de nitrógeno disponibles para que los utilicen los productores de vino. La mayoría de ellos son fórmulas complejas que incluyen nitrógeno (ya sea de aminoácidos o sales de amonio) junto con vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento y se venden bajo marcas como Go-Ferm , Superfood y Fermaid K (las dos últimas también contienen algo de DAP). [2] Los aminoácidos se pueden agregar directamente al mosto, aunque a partir de 2010 solo se permite agregar glicina al mosto en los Estados Unidos. [4]
Las cáscaras de levadura (o fantasmas de levadura) son los restos de las paredes celulares de las levaduras que quedan de la producción comercial de cepas de levadura que se utilizan para la inoculación. Además de proporcionar una fuente de nitrógeno asimilable a partir de aminoácidos, también proporcionan lípidos y esteroles que pueden ser utilizados por las células para fortalecer su membrana plasmática, lo que permite la absorción de otras fuentes de nitrógeno. [2]
Los suplementos de nitrógeno, en particular el DAP, estimulan la reproducción de la levadura y pueden aumentar considerablemente la biomasa. Esto podría tener como consecuencia acelerar la velocidad de fermentación más rápido de lo que un enólogo podría desear y también aumentará la temperatura de fermentación debido al calor generado por la levadura. El exceso de biomasa también puede crear una escasez de otros nutrientes de la levadura, como vitaminas y esteroles, debido al aumento de la competencia y puede conducir a la producción de olores desagradables (como sulfuro de hidrógeno) e incluso fermentaciones estancadas. [1]
Los niveles excesivos del aminoácido arginina (superiores a 400 mg/L), especialmente cerca del final de la fermentación, pueden suponer el riesgo de aumentar la producción de carbamato de etilo. Esto se debe a que la arginina se descompone en urea, que puede ser reabsorbida y utilizada por la levadura o metabolizada en amoníaco. Sin embargo, la urea también reacciona con el etanol si no se metaboliza por completo, lo que, sumado a la exposición a largo plazo (así como a altas temperaturas), puede conducir a la producción del éster carbamato de etilo. [1]
Sin embargo, el mayor riesgo de suplementar en exceso un mosto es que el exceso de nitrógeno y otros nutrientes queden después de que se complete la fermentación. Esto puede crear inestabilidad microbiana, ya que los organismos que provocan la descomposición pueden utilizar estos nutrientes en exceso. [3]
En los Estados Unidos, la Oficina de Comercio e Impuestos sobre el Alcohol y el Tabaco (TTB) limita el uso de fosfato diamónico como aditivo de nitrógeno a 968 mg/L (8 lbs/1000 gal), lo que proporciona 203 mg N/L de YAN. En la Unión Europea , la mayoría de los países siguen las directrices de la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV), que dicta un límite de 300 mg/L. En Australia , el límite se basa en el nivel de fosfato inorgánico con un límite máximo de 400 mg/L de fosfato permitido. [2]
Como la mayoría de los suplementos nutricionales alimentan a todos los microorganismos vivos del mosto (ya sea deseable o no), los productores de vino suelen esperar para añadir los nutrientes hasta que estén listos para inocular el mosto con la cepa de S. cerevisiae deseada . Los productores que utilizan fermentos silvestres también pueden esperar hasta que las adiciones de dióxido de azufre hayan matado a los microbios no deseados o alimentar antes porque les gustaría la complejidad potencial que otros microbios podrían añadir al vino. Cuando se añade, el nitrógeno suele estar en forma de aminoácidos, combinados con vitaminas y minerales para ayudar a poner en marcha la fermentación. [2]
Poco después de la inoculación, la levadura comienza a consumir rápidamente el nitrógeno asimilable disponible y hasta el 46 % del nitrógeno asimilable se consume por completo al inicio de la fermentación completa. [1] Debido a que el nitrógeno inorgánico, como las sales de amonio en DAP, son tóxicas para la levadura en niveles altos, nunca se agrega durante la inoculación cuando la biomasa de la levadura recién rehidratada es baja. Muchos enólogos dividen la dosis de DAP y la primera adición se realiza al final de la fase de latencia , cuando la levadura ingresa en su período de crecimiento exponencial y comienza la fermentación alcohólica. En la mayoría de los mostos, esto ocurre alrededor de 48 a 72 horas después de la inoculación. A menudo, se añade una segunda dosis cuando se ha completado aproximadamente un tercio de la fermentación del azúcar y, a menudo, antes de que los niveles de azúcar alcancen los 12-10 grados Brix (6,5 a 5,5 grados Baumé, 48,3 a 40,0 grados Oechsle), ya que, a medida que avanza la fermentación, las células de levadura ya no pueden llevar el nitrógeno a la célula debido a la creciente toxicidad del etanol que las rodea. Esto deja el nitrógeno sin utilizar y disponible para los organismos causantes de la descomposición que puedan aparecer después. [2] [3]
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