El azul alcián ( / ˈ æ l ʃ ə n / ) es cualquier miembro de una familia de colorantes básicos polivalentes, de los cuales el azul alcián 8G (también llamado azul Ingrain 1 y CI 74240 , anteriormente llamado azul alcián 8GX por el nombre de un lote de un producto ICI ) ha sido históricamente el miembro más común y más confiable. [1] Se utiliza para teñir polisacáridos ácidos como glicosaminoglicanos en cartílagos y otras estructuras corporales, algunos tipos de mucopolisacáridos , glicocáliz sialilado de células, etc. Para muchos de estos objetivos, es uno de los colorantes catiónicos más utilizados tanto para microscopía óptica como electrónica . El uso de azul alcián ha sido históricamente un método de tinción popular en histología, especialmente para microscopía óptica en secciones incluidas en parafina y en secciones de resina semidelgada. Las partes de tejido que se tiñen específicamente con este colorante se vuelven de color azul a verde azulado después de la tinción y se denominan "alcianófilas" (comparable a " eosinófilas " o " sudanofílicas "). La tinción con azul alcian se puede combinar con tinción H&E , tinción PAS y métodos de tinción de van Gieson . El azul alcian se puede utilizar para cuantificar glicanos ácidos tanto en cuantificación microespectrofotométrica en solución como para teñir glicoproteínas en geles de poliacrilamida o en transferencias Western . Los bioquímicos lo han utilizado para analizar polisacáridos ácidos en orina desde la década de 1960 para el diagnóstico de enfermedades como la mucopolisacaridosis , pero a partir de la década de 1970, en parte debido a la falta de disponibilidad de alcian y en parte debido a la duración y la tediosidad del procedimiento, se tuvieron que desarrollar métodos alternativos, por ejemplo, el método del azul de dimetilmetileno (DMB o DMMB). [2]
John E. Scott, la primera persona ajena a la industria de los tintes que descifró el secreto químico de este tinte, comenta:
Además de su amplio uso como colorante, el azul alcián también se ha utilizado en otras aplicaciones diversas, por ejemplo, como agente gelificante para fluidos lubricantes, modificadores para electrodos, agentes de recubrimiento cargados, etc.
El azul Monstral encontrado para recubrir el interior de los recipientes de cobre utilizados para procesar derivados del ácido ftálico había llevado al descubrimiento de la ftalocianina en 1907. Atraídos por el brillo, la estabilidad y la insolubilidad de este cromóforo , se hicieron intentos de modificarlo reversiblemente para que pudiera ser transportado a la tela en una solución y luego precipitado fácilmente (incrustado) en un depósito no lixiviable pero finamente bien disperso (de ahí el nombre de " tintura de ingrain "). A partir de este intento, el azul Alcian (azul Ingrain 1) fue sintetizado por primera vez por el departamento de colorantes ICI bajo NH Haddock y C. Wood [4] a principios de la década de 1940 y patentado en 1947, originalmente como un tinte textil. [5] [6] En 1950 fue utilizado por Steedman como un tinte selectivo para mucinas. [7] Si bien la popularidad del azul alcián se expandió exponencialmente, la dificultad involucrada en su producción debido a los pasos intermedios peligrosos para el medio ambiente dificultó su disponibilidad e ICI dejó de producirlo en 1973. Muchas de las fuentes alternativas vendían productos de color de apariencia similar con tinción poco confiable.
El profesor JE Scott trabajó para descifrar la química del azul alcián, que sólo era conocido por la industria pero que se mantenía como un secreto comercial estricto. Después de dedicar tres años de trabajo en 1972, publicó la estructura del azul alcián y logró que ICI la confirmara en 1973, casualmente en el mismo momento en que ICI también acababa de dejar de producirlo. [8]
Después de la crisis interina desde la década de 1970, cuando ICI tuvo que parar, ahora ha habido una fabricación industrial alternativa y ambientalmente segura de este tinte que se supone que funciona tan bien como el 8GX, pero se llama 8G porque se fabrica de manera diferente. [9] En un intento de responder cuál fue la importancia de descubrir un método alternativo para fabricar este compuesto, una empresa (Anatech Ltd, EE. UU.) que remanufacturaba azul alcián dice:
La etimología del nombre no es segura, y si se debe escribir con mayúscula es una elección de estilo editorial. Dos diccionarios científicos y médicos importantes utilizan el estilo con minúsculas, [10] [11] pero también hay un respaldo digno para el estilo con mayúsculas (que se analiza a continuación). Según el diccionario de quimioetimología de Elsevier, el término alciano en azul alcián podría haberse acuñado por contracción (y ligera alteración) de ftalocianina . ". [12] El diccionario en línea de Oxford menciona que era una marca registrada y también especifica [13]
Esta hipótesis es consistente con el nombre de verde alcián, que es una tetrafenil-ftalocianina con cobre. [14]
Sin embargo, el profesor JE Scott, que había descifrado él mismo la química del azul alcián y más tarde recibió confirmación del fabricante (ICI), escribió que Alcian era una marca registrada que ICI prefería que se escribiera empezando con una "A" mayúscula, y presume que provenía de la antigua palabra inglesa " halcyon ", que tiene una "asociación romántica y poética con el pájaro martín pescador y los mares en calma". [3] El profesor Scott también afirma que el verde alcián era simplemente una mezcla de azul alcián y amarillo alcián y no un solo compuesto, lo que también está respaldado por datos de cromatografía de capa fina de varias fuentes, por ejemplo, trabajos de otro experto en tintes, el profesor RW Horobin, uno de los dos editores jefe de la décima edición del Manual de tinciones biológicas de Conn, de 75 años de antigüedad, publicado en nombre de la Comisión de tinciones biológicas . [15]
El amarillo alcián es un colorante azoico que no tiene un anillo de ftalocianina ni ninguno de los colores del martín pescador, pero que, en común con el azul alcián, tiene cadenas laterales de tiouronio cargadas hidrolizables y una estabilidad similar del producto final teñido. Por otro lado, existen otros colorantes de ftalocianina , como el azul rápido Luxol y el azul Durazol, que no han adquirido la palabra "alcián" como parte de sus nombres. [16]
El azul alcián sólido se obtiene en forma de cristales de color negro verdoso (o, a veces, violeta azulado oscuro [17] ) con brillo metálico. La solución acuosa es de un azul verdoso brillante. Aunque el compuesto azul alcián en sí es inestable (véase estabilidad a continuación), la tinción que produce es estable y resistente a la luz.
A diferencia de las tiazinas tricíclicas (por ejemplo, azul de toluidina , azul de metileno y azur A, etc.), que son metacromáticas debido al cambio de monómeros a agregados apilados , el azul Alcian es aparentemente ortocromático . Al igual que el azul Astra y otros colorantes similares, esta propiedad de que no cambia de color ni por cambio de concentración ni por combinación con sustratos, lo hace muy adecuado para la microespectrofotometría. La aparente falta de metacromasia no se debe a que sea verdaderamente ortocromático , sino a que "ya es completamente metacromático" en solución acuosa. [3]
En solución acuosa, un gran número de moléculas de azul alcián se apilan juntas formando micelas de un tamaño muy grande, demasiado grandes para ser dializadas. Por lo tanto, incluso a una dilución bastante alta, tiene un máximo de absorción a ~600–615 nm, que en realidad no es el máximo de absorción de un monómero de tinte sino el del multímero. Dado que la luz absorbida es de espectro naranja amarillento, nuestro ojo percibe la luz transmitida/reflejada como el color complementario de azul ligeramente verdoso o cian . En solución acuosa, los azules alcián continúan siendo metacromáticos a concentraciones molares una centésima parte de aquellas en las que el azul de toluidina es principalmente ortocromático. Solo un hombro muy pequeño de la curva de absorción a 670–680 nm representa el tinte monomérico, que generalmente es minoritario y se vuelve aún menos minoritario (<10 8 M) en presencia de sales. Sin embargo, cuando el solvente es DMSO , un solvente no prótico de constante dieléctrica moderadamente alta, el azul alcián no se agrega y se puede visualizar bien un gran pico de absorción monomérico. También se observa un cambio espectral similar al pico monomérico más largo cuando se utilizan disolventes como etanol (o una mezcla de etanol y agua) como vehículo o cuando se utilizan detergentes no iónicos como Triton X-100 , que forman micelas exógenas.
El azul de Alcian contiene ftalocianina, uno de los cromóforos más coloreados conocidos hasta ahora, con una extinción molar de 120.000, es decir, el azul de Alcian se puede detectar a la mitad de la concentración molar de colorantes populares como el azul de toluidina , los triarilmetanos (por ejemplo, la pararosanilina y las bases de Schiff análogas utilizadas en la tinción PAS , el violeta cristal en la tinción de Gram ), etc.
Es soluble en agua. Cuando cada uno de los pares de sustituyentes en los nitrógenos del grupo colgante es toluilo, la solubilidad en agua a 20 °C es de aproximadamente 9,5% p/p; y de manera similar, algunas otras solubilidades son: 6,0% en etanol absoluto , 6,0% en Cellosolve y 3,25% en etilenglicol, mientras que es prácticamente insoluble en xileno. En términos relativos/de partición, Alcian Blue 8G tiene un coeficiente de partición octanol-agua logarítmico (Log P) de −9,7, lo que sugiere que es bastante soluble en agua (soluble en lípidos si Log P > 0, y las buenas tinciones de lípidos generalmente tienen un Log P > 7). [18] El metanol es un sustituto aceptable del etanol como un vehículo potencial para el azul alcián, pero el isopropano no lo es, porque, en unas pocas horas, todo el azul alcián suspendido precipita si se prueba el isopropano como vehículo. [19]
El compuesto de muestra con número de índice Merck 218 tiene un punto de fusión de 148 °C.
Es un colorante básico tetravalente (catiónico) con un núcleo de ftalocianina de cobre (Cu2 + , coordinación 4 de 6, configuración orbital d9 con distorsión de Jahn-Teller ) ( CuPc ) con tres o cuatro cadenas laterales colgantes de isotiouronio que le imparten volumen y cargas positivas. Para calificar como miembro de la familia del azul alcián, tiene que haber al menos 2 cadenas laterales y las mezclas a menudo tienen 3 cadenas en promedio para calificar como 8G. En la imagen se muestran cuatro grupos de tetrametilisotiouronio por molécula. ICI había afirmado un promedio de aproximadamente tres cadenas laterales por molécula, pero los análisis del laboratorio del profesor Scotts sugirieron entre tres y cuatro. La mayoría de ellas están en las posiciones 2(3), como en la fórmula y, a veces, una representación de dibujos animados utiliza el puente de metileno que cruza el enlace entre estas dos posiciones para indicar que podría unirse a cualquiera de estas dos posiciones. Es posible una gran cantidad de isómeros, que difieren en las posiciones de los grupos catiónicos. El azul alcián 7GX contiene menos grupos isotiouronio que el 8GX. De manera similar, el 5GX y el 2GX pueden tener incluso menos grupos laterales, pero esto no se ha demostrado rigurosamente.
El núcleo aromático de la ftalocianina tiene un gran sistema conjugado con un CBN (número de enlace conjugado) de 48. [18] Sin embargo, son las cargas de los grupos laterales de isotiouronio las que lo mantienen soluble en agua. Estos grupos laterales pueden llevar sustituyentes alquilo o arilo más voluminosos en lugar de los grupos metilo 8x2 como en la imagen dada. Estos grupos se separan del anillo macrocíclico durante el lavado al final de la tinción o en condiciones bastante suaves (por ejemplo, pH superior a 5,6) o durante la degradación espontánea.
Los metales en el núcleo de ftalocianina y los grupos sustituidos directamente unidos al núcleo aromático determinan los colores de los miembros de la familia de las ftalocianinas metálicas, por ejemplo, el azul alcián y la propia ftalocianina de cobre son azules, pero la ftalocianina de cobre bromada o clorada y la ftalocianina de cobre sulfonada son verdes.
El azul alcián tiene una solubilidad relativamente alta en soluciones salinas y se tiñe más lentamente que otros colorantes. Al cambiar el pH o las concentraciones de sal en el ambiente se pueden obtener patrones de tinción característicos.
A pH 1,0 tiñe sólo polisacáridos sulfatados y a pH 2,5 tiñe también azúcares que contienen grupos carboxilo como los ácidos siálicos y urónicos intensificando la tinción de los ácidos hialurónicos , que también se tiñen aunque relativamente débilmente con sus ésteres semisulfatos a pH 1,0. [20]
Método de tinción en el que, a un pH fijo de aproximadamente 5,5, se pueden utilizar diferentes concentraciones críticas de sal (clásicamente, MgCl2 , pero NaCl, KCl y LiBr son alternativas potenciales) donde el catión de sal más pequeño (que se difunde más rápido) compite con el azul alcián para unirse a los sitios aniónicos. Se supone que la concentración crítica de electrolito (CEC) específica del material objetivo identifica selectivamente estructuras sulfatadas, carboxiladas y fosfatadas, por ejemplo, como objetivos.
Según John A. Kiernan, uno de los editores de la décima edición de Conn's Biological Stains", 10.ª ed. 2002, publicada en nombre de la Biological Stain Commission : [21] El azul alcián 8G se diferencia de la mayoría de los demás colorantes en que puede deteriorarse incluso en estado sólido y convertirse en un pigmento insoluble. Las soluciones ácidas de azul alcián 8G suelen ser estables durante algunos años. El manual de laboratorio de Churukian [1] indica una vida útil recomendada de 6 meses. Una solución de azul alcián con un precipitado debe desecharse y reemplazarse, no filtrarse y usarse. Algunos colorantes que se venden como azul alcián 8G son inestables en soluciones a un pH de 5,6 o superior; precipitan en menos de 24 horas. Los lotes de azul alcián que no forman soluciones estables no se pueden utilizar en los métodos de "concentración crítica de electrolitos" de Scott para la caracterización histoquímica de diferentes glicosaminoglicanos, que requieren soluciones a un pH de 5,6 o superior. 5,7-5,8 con concentraciones variables de MgCl 2 .
La variante de piridina del azul alcián (cloruro de azul alcián-tetrakis(metilpiridinio), CAS , CB6503730, PubChem 24860335) es más estable que los colorantes azules alcián originales y puede ser tan buena como tinción. [22]
Los ácidos nucleicos son generalmente basófilos porque tienen una densidad muy alta de carga negativa debido a la cadena principal de fosfato de azúcar. Sin embargo, a diferencia de otros colorantes básicos, es decir, catiónicos, el azul alcián generalmente (dado el pH y las concentraciones de sal adecuados, y la temperatura normal y la duración en minutos, no horas) tiñe preferiblemente los glicosaminoglicanos ácidos pero no la cromatina y la sustancia Nissl, cuyo mecanismo había sido un misterio durante mucho tiempo y se propusieron varias teorías. Aunque la base presunta de la tinción es su carga positiva atraída por las estructuras negativas (por ejemplo, azúcares ácidos), la voluminosidad (ancho 2,5-3 nm, en comparación con el azul de toluidina ~0,7 x1,1 nm [23] ) hace que su difusión sea muy lenta en partes menos permeables del tejido y, por lo tanto, evita que tiña estructuras altamente negativas pero compactas como la cromatina y la sustancia Nissl. [24] Sin embargo, la tinción prolongada (unos días a 25 °C) o las condiciones desnaturalizantes del ADN pueden permitir que el azul alcián también tiña el núcleo. El aislamiento de la carga positiva de la nube de electrones aromáticos por los puentes de metileno intermedios hace que las regiones cargadas positivamente localizadas sean iones "duros" en contraste con los iones blandos donde la carga está deslocalizada en toda la nube pi aromática. [9] Cuando estos cationes duros encuentran los aniones duros, por ejemplo en forma de sulfato, forman sales sin tener en cuenta la naturaleza química precisa del anión. Las sales resultantes son altamente estables pero se pueden intercambiar lentamente con una alta concentración de sales. El lavado con agua o un tratamiento alcalino después de la tinción provoca una hidrólisis catalizada por una base y la eliminación de las cadenas laterales colgantes cargadas positivamente y el compuesto resultante es el azul de ftalocianina , que forma un precipitado de tinte azul insoluble en agua. [25] Los precipitados son tan robustos que resisten condiciones duras como PAS u otra contratinción y también tratamientos de deshidratación e inclusión (en contraste, el azul de toluidina se extrae parcialmente durante la deshidratación). Esta inlimpieza es la base química del teñido con injerto para el cual la industria de los tintes diseñó originalmente el tinte AB (Ingrain blue 1).
El azul alcián histórico variaba tanto de un lote a otro que más tarde se decidió que solo el lote 8GX (es decir, ni siquiera el 8GS) producido por ICI era el biológicamente útil. Los lotes disponibles comercialmente generalmente contenían alrededor del 49% del colorante real y el resto solía ser sulfato, ácido bórico, dextrina y otras impurezas y, mediante varios métodos de extracción, se pueden hacer extractos con una pureza de hasta el 80%. En realidad, el colorante no necesariamente contiene los 4 sustituyentes, sino que puede contener 2 o 3 de ellos y tener varios isómeros geométricos. Pero, de todos modos, la fabricación de 8GX por parte de ICI se detuvo a mediados de la década de 1970 debido a los riesgos ambientales y había lotes muy pequeños disponibles que se recibían de fuentes alternativas. Solo recientemente, el azul alcián se ha vuelto a fabricar a granel utilizando procedimientos más seguros, pero el producto más nuevo no tiene el sufijo X (o S) ya que el proceso de fabricación (y la composición exacta del producto) es algo diferente. [9]
El azul alcián es un irritante para los ojos y las vías respiratorias. El azul alcián sólido es un polvo combustible y nunca debe manipularse cerca del calor o de una llama abierta. Calentar el azul alcián produce humos tóxicos de compuestos de nitrógeno. Puede reaccionar violentamente si se mezcla con materiales oxidantes. La solución de azul alcián es un sensibilizador cutáneo y corrosivo (en parte debido al pH ácido necesario para mantenerlo sin hidrolizar en solución) y nocivo por absorción cutánea. La mayoría de las hojas de datos de seguridad de materiales de los proveedores mencionan que se desconoce el efecto de la ingestión o el órgano diana. Sin embargo, algunos mencionan que los órganos diana potenciales son los dientes y los riñones. [26]
Esta tintura fue descubierta originalmente por ICI en la década de 1940 como parte de la competitiva industria de tinturas con el propósito de teñir de manera industrial. Se utilizó durante algún tiempo para teñir textiles, productos de cuero y tintas. ICI vendió miles de toneladas de azul alcián y presentó múltiples patentes relacionadas con su proceso de fabricación para mantener su composición química en secreto. Sin embargo, ICI había tenido problemas con la solubilidad de la tintura en condiciones de teñido de textiles, y se realizaron varios cambios en el proceso de fabricación durante las décadas de 1950 y 1960.
Además de su uso como tinte o colorante, el azul alcián también encuentra otros usos en la ciencia de los materiales.
El azul alcián se ha utilizado como adhesivo para ayudar a pegar secciones de metacrilato de glicol a portaobjetos de vidrio (que tienen grupos de silicato cargados negativamente). [27]
El azul alcián tiene una gran superficie aromática que puede participar en la interacción de Van der Waals, así como múltiples cargas localizadas. Por lo tanto, puede recubrir superficies y modificar significativamente las propiedades y la carga de la superficie. Algunas células en cultivo crecen mejor en superficies recubiertas con carga positiva como poli-L-lisina o poliornitina o azul alcián. Las superficies recubiertas de azul alcián se adhieren al glicocáliz de carga negativa con tanta fuerza que incluso se puede utilizar para cubrir una capa de células y luego flotar para despegar el techo ("destechar") y estudiar el lado citoplasmático de la membrana plasmática. [28]
El azul alcián se ha utilizado como agente gelificante para fluidos lubricantes, probablemente debido a las propiedades de apilamiento de este compuesto aromático macrocíclico .
{{citation}}: Mantenimiento de CS1: postscript ( enlace )