La espectrometría de masas de tiempo de vuelo ( TOFMS ) es un método de espectrometría de masas en el que la relación masa-carga de un ion se determina mediante una medición del tiempo de vuelo . Los iones son acelerados por un campo eléctrico de intensidad conocida. [1] Esta aceleración da como resultado un ion que tiene la misma energía cinética que cualquier otro ion que tenga la misma carga. La velocidad del ion depende de la relación masa-carga (los iones más pesados de la misma carga alcanzan velocidades más bajas, aunque los iones con mayor carga también aumentarán su velocidad). Se mide el tiempo que posteriormente tarda el ion en alcanzar un detector a una distancia conocida. Este tiempo dependerá de la velocidad del ion y, por lo tanto, es una medida de su relación masa-carga. A partir de esta relación y de parámetros experimentales conocidos, se puede identificar el ion.
La energía potencial de una partícula cargada en un campo eléctrico está relacionada con la carga de la partícula y con la intensidad del campo eléctrico:
donde Ep es la energía potencial, q es la carga de la partícula y U es la diferencia de potencial eléctrico (también conocida como voltaje).
Cuando la partícula cargada se acelera hacia el interior de un tubo de tiempo de vuelo (tubo TOF o tubo de vuelo) mediante el voltaje U , su energía potencial se convierte en energía cinética . La energía cinética de cualquier masa es:
En efecto, la energía potencial se convierte en energía cinética, lo que significa que las ecuaciones ( 1 ) y ( 2 ) son iguales.
La velocidad de la partícula cargada después de la aceleración no cambiará ya que se mueve en un tubo de tiempo de vuelo sin campo. La velocidad de la partícula se puede determinar en un tubo de tiempo de vuelo ya que se conoce la longitud del camino ( d ) del vuelo del ion y el tiempo del vuelo del ion ( t ) se puede medir utilizando un digitalizador transitorio o un convertidor de tiempo a digital .
De este modo,
y sustituimos el valor de v en ( 5 ) en ( 4 ).
Reorganizando ( 6 ) de modo que el tiempo de vuelo se exprese por todo lo demás:
Tomando la raíz cuadrada obtenemos el tiempo,
Estos factores para el tiempo de vuelo se han agrupado deliberadamente. contiene constantes que en principio no cambian cuando se analiza un conjunto de iones en un solo pulso de aceleración . ( 8 ) por lo tanto se puede dar como:
donde k es una constante de proporcionalidad que representa factores relacionados con la configuración y las características del instrumento.
( 9 ) revela más claramente que el tiempo de vuelo del ion varía con la raíz cuadrada de su relación masa-carga ( m/q ).
Consideremos un ejemplo del mundo real de un instrumento espectrómetro de masas de tiempo de vuelo MALDI que se utiliza para producir un espectro de masas de los péptidos trípticos de una proteína . Supongamos que la masa de un péptido tríptico es de 1000 daltons ( Da ). El tipo de ionización de los péptidos producidos por MALDI es típicamente iones +1, por lo que q = e en ambos casos. Supongamos que el instrumento está configurado para acelerar los iones en un potencial U = 15.000 voltios (15 kilovoltios o 15 kV). Y supongamos que la longitud del tubo de vuelo es de 1,5 metros (típico). Ahora se conocen todos los factores necesarios para calcular el tiempo de vuelo de los iones para ( 8 ), que se evalúa primero del ion de masa 1000 Da:
Tenga en cuenta que la masa se tuvo que convertir de daltons (Da) a kilogramos (kg) para que fuera posible evaluar la ecuación en las unidades adecuadas. El valor final debe expresarse en segundos:
que son aproximadamente 28 microsegundos . Si hubiera un ion de péptido tripsídico con una sola carga con una masa de 4000 Da, y es cuatro veces más grande que la masa de 1000 Da, tomaría el doble de tiempo, o aproximadamente 56 microsegundos, atravesar el tubo de vuelo, ya que el tiempo es proporcional a la raíz cuadrada de la relación masa-carga.
La resolución de masas se puede mejorar en el espectrómetro de masas MALDI -TOF axial, donde la producción de iones tiene lugar en vacío, permitiendo que la ráfaga inicial de iones y neutros producida por el pulso láser se equilibre y permita que los iones viajen cierta distancia perpendicularmente a la placa de muestra antes de que los iones puedan acelerarse hacia el tubo de vuelo. El equilibrio de iones en la columna de plasma producida durante la desorción/ionización tiene lugar aproximadamente 100 ns o menos, después de lo cual la mayoría de los iones, independientemente de su masa, comienzan a moverse desde la superficie con cierta velocidad promedio. Para compensar la dispersión de esta velocidad promedio y mejorar la resolución de masas, se propuso retrasar la extracción de iones de la fuente de iones hacia el tubo de vuelo unos pocos cientos de nanosegundos a unos pocos microsegundos con respecto al inicio del pulso láser corto (normalmente, unos pocos nanosegundos). Esta técnica se conoce como "enfoque con retardo de tiempo" [3] para la ionización de átomos o moléculas por ionización multifotónica mejorada por resonancia o por ionización por impacto de electrones en un gas enrarecido y "extracción retardada" [4] [5] [6] para iones producidos generalmente por desorción/ionización láser de moléculas adsorbidas en superficies planas o microcristales colocados en superficies planas conductoras.
La extracción retardada se refiere generalmente al modo de operación de las fuentes de iones de vacío cuando el inicio del campo eléctrico responsable de la aceleración (extracción) de los iones en el tubo de vuelo se retrasa durante un breve período de tiempo (200–500 ns) con respecto al evento de ionización (o desorción/ionización). Esto difiere de un caso de campo de extracción constante donde los iones se aceleran instantáneamente al formarse. La extracción retardada se utiliza con fuentes de iones MALDI o desorción/ionización láser (LDI) donde los iones que se van a analizar se producen en una columna en expansión que se mueve desde la placa de muestra a alta velocidad (400–1000 m/s). Dado que el espesor de los paquetes de iones que llegan al detector es importante para la resolución de masa, en una primera inspección puede parecer contraintuitivo permitir que la columna de iones se expanda aún más antes de la extracción. La extracción retardada es más bien una compensación del momento inicial de los iones: proporciona los mismos tiempos de llegada al detector para iones con la misma relación masa-carga pero con diferentes velocidades iniciales.
En la extracción retardada de iones producida en vacío, los iones que tienen un momento menor en la dirección de la extracción comienzan a acelerarse a un potencial más alto debido a que están más lejos de la placa de extracción cuando se activa el campo de extracción. Por el contrario, aquellos iones con un mayor momento hacia adelante comienzan a acelerarse a un potencial más bajo ya que están más cerca de la placa de extracción. A la salida de la región de aceleración, los iones más lentos en la parte posterior de la columna se acelerarán a una mayor velocidad que los iones inicialmente más rápidos en la parte delantera de la columna. Entonces, después de la extracción retardada, un grupo de iones que abandona la fuente de iones antes tiene una velocidad menor en la dirección de la aceleración en comparación con algún otro grupo de iones que abandona la fuente de iones más tarde pero con mayor velocidad. Cuando los parámetros de la fuente de iones se ajustan correctamente, el grupo de iones más rápido alcanza al más lento a cierta distancia de la fuente de iones, por lo que la placa detectora colocada a esta distancia detecta la llegada simultánea de estos grupos de iones. A su manera, la aplicación retardada del campo de aceleración actúa como un elemento de enfoque de tiempo de vuelo unidimensional.
La distribución de energía cinética en la dirección del vuelo de iones se puede corregir utilizando un reflectrón. [7] [8] El reflectrón utiliza un campo electrostático constante para reflejar el haz de iones hacia el detector. Los iones más energéticos penetran más profundamente en el reflectrón y toman un camino ligeramente más largo hasta el detector. Los iones menos energéticos de la misma relación masa-carga penetran una distancia más corta en el reflectrón y, correspondientemente, toman un camino más corto hasta el detector. La superficie plana del detector de iones (normalmente una placa de microcanal , MCP) se coloca en el plano donde los iones de la misma m/z pero con diferentes energías llegan al mismo tiempo contado con respecto al inicio del pulso de extracción en la fuente de iones. Un punto de llegada simultánea de iones de la misma relación masa-carga pero con diferentes energías a menudo se denomina foco de tiempo de vuelo. Una ventaja adicional de la disposición re-TOF es que se logra el doble de la trayectoria de vuelo en una longitud dada del instrumento TOF.
Un obturador Bradbury-Nielsen es un tipo de compuerta iónica utilizada en espectrómetros de masas TOF y en espectrómetros de movilidad iónica , así como en espectrómetros de masas TOF por transformada de Hadamard . [9] El obturador Bradbury-Nielsen es ideal para el selector de iones de tiempo rápido (TIS), un dispositivo utilizado para aislar iones en un rango de masas estrecho en espectrómetros de masas MALDI en tándem (TOF/TOF). [10]
Las fuentes de iones continuas (más comúnmente ionización por electrospray, ESI) generalmente se interconectan con el analizador de masas TOF mediante "extracción ortogonal", en la que los iones introducidos en el analizador de masas TOF se aceleran a lo largo del eje perpendicular a su dirección inicial de movimiento. La aceleración ortogonal combinada con el enfriamiento de iones por colisión permite separar la producción de iones en la fuente de iones y el análisis de masas. En esta técnica, se puede lograr una resolución muy alta para los iones producidos en fuentes MALDI o ESI. Antes de ingresar a la región de aceleración ortogonal o al pulsador, los iones producidos en fuentes continuas (ESI) o pulsadas (MALDI) se enfocan (enfrían) en un haz de 1 a 2 mm de diámetro mediante colisiones con un gas residual en guías multipolares de RF. Un sistema de lentes electrostáticas montadas en la región de alto vacío antes del pulsador hace que el haz sea paralelo para minimizar su divergencia en la dirección de la aceleración. La combinación del enfriamiento por colisión de iones y la aceleración ortogonal TOF [12] [13] ha proporcionado un aumento significativo en la resolución del TOF MS moderno de unos pocos cientos a varias decenas de miles sin comprometer la sensibilidad.
La espectrometría de masas de tiempo de vuelo por transformada de Hadamard (HT-TOFMS) es un modo de análisis de masas que se utiliza para aumentar significativamente la relación señal-ruido de un TOFMS convencional. [14] Mientras que el TOFMS tradicional analiza un paquete de iones a la vez, esperando a que los iones lleguen al detector antes de introducir otro paquete de iones, el HT-TOFMS puede analizar simultáneamente varios paquetes de iones que viajan en el tubo de vuelo. [15] Los paquetes de iones se codifican modulando rápidamente la transmisión del haz de iones, de modo que los iones más ligeros (y por lo tanto más rápidos) de todos los paquetes de masa liberados inicialmente de un haz se adelantan a los iones más pesados (y por lo tanto más lentos). [16] Este proceso crea una superposición de muchas distribuciones de tiempo de vuelo convolucionadas en forma de señales. El algoritmo de transformada de Hadamard se utiliza luego para llevar a cabo el proceso de deconvolución que ayuda a producir una tasa de almacenamiento espectral de masas más rápida que el TOFMS tradicional y otros instrumentos de separación de masas comparables. [14]
El tiempo de vuelo en tándem ( TOF/TOF ) es un método de espectrometría de masas en tándem en el que se utilizan dos espectrómetros de masas de tiempo de vuelo de forma consecutiva. [17] [18] [19] [20] Para registrar el espectro completo de iones precursores (padres), el TOF/TOF funciona en modo MS. En este modo, la energía del láser de pulso se elige ligeramente por encima del inicio de MALDI para la matriz específica en uso para asegurar el compromiso entre un rendimiento iónico para todos los iones parentales y una fragmentación reducida de los mismos iones. Cuando se opera en modo tándem (MS/MS), la energía del láser aumenta considerablemente por encima del umbral de MALDI. El primer espectrómetro de masas TOF (básicamente, un tubo de vuelo que termina con el selector de iones temporizado) aísla los iones precursores de elección utilizando un filtro de velocidad, típicamente, de tipo Bradbury-Nielsen, y el segundo TOF-MS (que incluye el postacelerador, el tubo de vuelo, el espejo de iones y el detector de iones) analiza los iones fragmentados. Los iones fragmentados en MALDI TOF/TOF resultan de la descomposición de iones precursores excitados vibracionalmente por encima de su nivel de disociación en la fuente MALDI (descomposición posterior a la fuente [21] ). Se puede agregar fragmentación iónica adicional implementada en una celda de colisión de alta energía al sistema para aumentar la tasa de disociación de iones precursores excitados vibracionalmente. Algunos diseños incluyen supresores de señal precursora como parte de un segundo TOF-MS para reducir la carga de corriente instantánea en el detector de iones.
La espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolo (QToF-MS) tiene una configuración similar a un espectrómetro de masas en tándem con un cuadrupolo de resolución de masas y un hexapolo de celda de colisión, pero en lugar de un segundo cuadrupolo de resolución de masas, se utiliza un analizador de masas de tiempo de vuelo. [22] [23] Ambos cuadrupolos pueden operar en modo RF solo para permitir que todos los iones pasen al analizador de masas con una fragmentación mínima. [22] Para aumentar el detalle espectral, el sistema aprovecha la disociación inducida por colisión . Una vez que los iones llegan al tubo de vuelo, el pulsador de iones los envía hacia arriba hacia el reflectrón y de regreso hacia abajo al detector. Dado que el pulsador de iones transfiere la misma energía cinética a todas las moléculas, el tiempo de vuelo está determinado por la masa del analito.
El QToF es capaz de medir la masa hasta el cuarto decimal y se utiliza con frecuencia para análisis farmacéuticos y toxicológicos como método de detección de análogos de fármacos. [24] La identificación se realiza mediante la recopilación del espectro de masas y la comparación con bibliotecas de espectros de masas en tándem. [25]
Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOFMS) consta de un analizador de masas y un detector. Se utiliza una fuente de iones (pulsada o continua) para experimentos TOF relacionados con el laboratorio, pero no es necesaria para los analizadores TOF utilizados en el espacio, donde el sol o las ionosferas planetarias proporcionan los iones. El analizador de masas TOF puede ser un tubo de vuelo lineal o un reflectrón. El detector de iones generalmente consta de un detector de placa de microcanal o un multiplicador de emisión secundaria rápido (SEM) donde la primera placa del convertidor ( dínodo ) es plana. [26] La señal eléctrica del detector se registra por medio de un convertidor de tiempo a digital (TDC) o un convertidor analógico a digital rápido (ADC). El TDC se utiliza principalmente en combinación con instrumentos TOF de aceleración ortogonal (oa).
Los convertidores de tiempo a digital registran la llegada de un único ion en "contenedores" de tiempo discretos; una combinación de activación por umbral y discriminador de fracción constante (CFD) discrimina entre ruido electrónico y eventos de llegada de iones. El CFD convierte pulsos eléctricos de forma gaussiana de nanosegundos de diferentes amplitudes generados en el ánodo del MCP en pulsos de forma común (por ejemplo, pulsos compatibles con circuitos lógicos TTL/ESL) enviados a TDC. El uso de CFD proporciona un punto de tiempo correspondiente a una posición de pico máximo independiente de la variación en la amplitud de pico causada por la variación de la ganancia del MCP o SEM. Los CFD rápidos de diseños avanzados tienen tiempos muertos iguales o menores que dos tiempos de respuesta de impacto único del detector de iones (el tiempo de respuesta de impacto único para MCP con canales de 2 a 5 micrones de ancho puede estar en algún lugar entre 0,2 ns y 0,8 ns, dependiendo del ángulo del canal), lo que evita la activación repetitiva del mismo pulso. La resolución de doble impacto (tiempo muerto) del TDC de múltiples impactos moderno puede ser tan baja como 3-5 nanosegundos.
El TDC es un detector de conteo: puede ser extremadamente rápido (hasta una resolución de unos pocos picosegundos), pero su rango dinámico es limitado debido a su incapacidad para contar correctamente los eventos cuando más de un ion simultáneamente (es decir, dentro del tiempo muerto del TDC) golpea el detector. El resultado del rango dinámico limitado es que el número de iones (eventos) registrados en un espectro de masas es menor en comparación con el número real. El problema del rango dinámico limitado se puede aliviar utilizando el diseño de detector multicanal: una matriz de miniánodos conectados a una pila MCP común y múltiples CFD/TDC, donde cada CFD/TDC registra señales de miniánodos individuales. Para obtener picos con intensidades estadísticamente aceptables, el conteo de iones se acompaña de la suma de cientos de espectros de masas individuales (lo que se denomina histograma). Para alcanzar una tasa de conteo muy alta (limitada solo por la duración del espectro TOF individual, que puede ser de hasta unos pocos milisegundos en configuraciones TOF de trayectoria múltiple), se utiliza una tasa de repetición muy alta de extracciones de iones al tubo TOF. Los analizadores de masas TOF de aceleración ortogonal comerciales suelen funcionar a frecuencias de repetición de 5 a 20 kHz. En los espectros de masas combinados obtenidos mediante la suma de una gran cantidad de eventos de detección de iones individuales, cada pico es un histograma obtenido mediante la suma de los recuentos en cada contenedor individual. Debido a que el registro de la llegada de iones individuales con TDC produce solo un único punto de tiempo, el TDC elimina la fracción del ancho del pico determinada por un tiempo de respuesta limitado tanto del detector MCP como del preamplificador. Esto se propaga a una mejor resolución de masa.
Los modernos convertidores analógico-digitales ultrarrápidos de 10 GSample/sec digitalizan la corriente de iones pulsada del detector MCP en intervalos de tiempo discretos (100 picosegundos). El ADC moderno de 8 bits o 10 bits a 10 GHz tiene un rango dinámico mucho mayor que el TDC, lo que permite su uso en instrumentos MALDI-TOF con sus altas corrientes de pico. Para registrar señales analógicas rápidas de detectores MCP, se requiere hacer coincidir cuidadosamente la impedancia del ánodo del detector con el circuito de entrada del ADC ( preamplificador ) para minimizar el efecto de "resonancia". La resolución de masas en espectros de masas registrados con ADC ultrarrápidos se puede mejorar utilizando detectores MCP de poro pequeño (2-5 micrones) con tiempos de respuesta más cortos.
La ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) es una técnica de ionización pulsada que es fácilmente compatible con TOF MS.
La tomografía de sonda atómica también aprovecha la espectrometría de masas TOF.
La espectroscopia de coincidencia de fotoiones y fotoelectrones utiliza la fotoionización suave para la selección de energía interna de iones y espectrometría de masas TOF para el análisis de masas.
La espectrometría de masas de iones secundarios comúnmente utiliza espectrómetros de masas TOF para permitir la detección paralela de diferentes iones con un alto poder de resolución de masa.
Stefan Rutzinger propuso utilizar la espectrometría de masas TOF con un detector criogénico para la espectrometría de biomoléculas pesadas . [27]
Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo temprano, llamado Velocitron, fue informado por AE Cameron y DF Eggers Jr, trabajando en el Complejo de Seguridad Nacional Y-12 , en 1948. La idea había sido propuesta dos años antes, en 1946, por WE Stephens de la Universidad de Pensilvania en una sesión de viernes por la tarde de una reunión, en el Instituto Tecnológico de Massachusetts , de la Sociedad Estadounidense de Física . [28] [29]
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