La espectrometría de masas de tiempo de vuelo ( TOFMS ) es un método de espectrometría de masas en el que la relación masa-carga de un ion se determina mediante una medición del tiempo de vuelo . Los iones son acelerados por un campo eléctrico de intensidad conocida. [1] Esta aceleración da como resultado un ion que tiene la misma energía cinética que cualquier otro ion que tenga la misma carga. La velocidad del ion depende de la relación masa-carga (los iones más pesados con la misma carga alcanzan velocidades más bajas, aunque los iones con mayor carga también aumentarán su velocidad). Se mide el tiempo que tarda el ion en llegar a un detector situado a una distancia conocida. Este tiempo dependerá de la velocidad del ion y, por tanto, es una medida de su relación masa-carga. A partir de esta relación y de los parámetros experimentales conocidos, se puede identificar el ion.
La energía potencial de una partícula cargada en un campo eléctrico está relacionada con la carga de la partícula y con la intensidad del campo eléctrico:
donde Ep es la energía potencial, q es la carga de la partícula y U es la diferencia de potencial eléctrico (también conocida como voltaje).
Cuando la partícula cargada es acelerada hacia el tubo de tiempo de vuelo (tubo TOF o tubo de vuelo) por el voltaje U , su energía potencial se convierte en energía cinética . La energía cinética de cualquier masa es:
En efecto, la energía potencial se convierte en energía cinética, lo que significa que las ecuaciones ( 1 ) y ( 2 ) son iguales.
La velocidad de la partícula cargada después de la aceleración no cambiará ya que se mueve en un tubo de tiempo de vuelo libre de campo. La velocidad de la partícula se puede determinar en un tubo de tiempo de vuelo ya que se conoce la longitud de la trayectoria ( d ) del vuelo del ion y el tiempo de vuelo del ion ( t ) se puede medir usando un Digitalizador transitorio o conversor de tiempo a digital .
De este modo,
y sustituimos el valor de v en ( 5 ) en ( 4 ).
Reorganizando ( 6 ) para que el tiempo de vuelo se exprese por todo lo demás:
Al sacar la raíz cuadrada se obtiene el tiempo,
Estos factores para el tiempo de vuelo se han agrupado expresamente. Contiene constantes que en principio no cambian cuando se analiza un conjunto de iones en un solo pulso de aceleración . ( 8 ) por lo tanto puede expresarse como:
donde k es una constante de proporcionalidad que representa factores relacionados con la configuración y características del instrumento.
( 9 ) revela más claramente que el tiempo de vuelo del ion varía con la raíz cuadrada de su relación masa-carga ( m/q ).
Considere un ejemplo del mundo real de un instrumento de espectrómetro de masas de tiempo de vuelo MALDI que se utiliza para producir un espectro de masas de los péptidos trípticos de una proteína . Supongamos que la masa de un péptido tríptico es de 1000 daltons ( Da ). El tipo de ionización de péptidos producidos por MALDI suele ser de iones +1, por lo que q = e en ambos casos. Suponga que el instrumento está configurado para acelerar los iones en un potencial U = 15 000 voltios (15 kilovoltios o 15 kV). Y supongamos que la longitud del tubo de vuelo es de 1,5 metros (típico). Ahora se conocen todos los factores necesarios para calcular el tiempo de vuelo de los iones ( 8 ), que se evalúa primero del ion de masa 1000 Da:
Tenga en cuenta que la masa tuvo que convertirse de daltons (Da) a kilogramos (kg) para que fuera posible evaluar la ecuación en las unidades adecuadas. El valor final debe estar en segundos:
que son unos 28 microsegundos . Si hubiera un ion peptídico tríptico con una sola carga y una masa de 4000 Da, y fuera cuatro veces mayor que la masa de 1000 Da, tomaría el doble de tiempo, o alrededor de 56 microsegundos, para atravesar el tubo de vuelo, ya que el tiempo es proporcional al cuadrado. raíz de la relación masa-carga.
La resolución de masa se puede mejorar en el espectrómetro de masas MALDI -TOF axial, donde la producción de iones tiene lugar en el vacío, permitiendo que la ráfaga inicial de iones y neutros producidos por el pulso láser se equilibre y permita que los iones viajen cierta distancia perpendicularmente a la placa de muestra antes de la Los iones se pueden acelerar hacia el interior del tubo de vuelo. El equilibrio de iones en la columna de plasma producido durante la desorción/ionización tiene lugar aproximadamente 100 ns o menos, después de eso la mayoría de los iones, independientemente de su masa, comienzan a moverse desde la superficie con una velocidad promedio. Para compensar la dispersión de esta velocidad promedio y mejorar la resolución de masa, se propuso retrasar la extracción de iones de la fuente de iones hacia el tubo de vuelo entre unos pocos cientos de nanosegundos y unos pocos microsegundos con respecto al inicio de los ciclos cortos (normalmente). , unos pocos nanosegundos) pulso láser. Esta técnica se conoce como "enfoque con retardo de tiempo" [3] para la ionización de átomos o moléculas mediante ionización multifotónica mejorada por resonancia o mediante ionización por impacto de electrones en un gas enrarecido y "extracción retardada" [4] [5] [6] para iones producidos generalmente por desorción/ionización por láser de moléculas adsorbidas en superficies planas o microcristales colocados sobre una superficie plana conductora.
La extracción retardada generalmente se refiere al modo de funcionamiento de las fuentes de iones de vacío cuando el inicio del campo eléctrico responsable de la aceleración (extracción) de los iones en el tubo de vuelo se retrasa un poco de tiempo (200 a 500 ns) con respecto a la ionización. o desorción/ionización). Esto difiere de un caso de campo de extracción constante donde los iones se aceleran instantáneamente al formarse. La extracción retardada se utiliza con fuentes de iones MALDI o desorción/ionización láser (LDI), donde los iones que se van a analizar se producen en una columna en expansión que se mueve desde la placa de muestra a alta velocidad (400–1000 m/s). Dado que el espesor de los paquetes de iones que llegan al detector es importante para la resolución de la masa, en una primera inspección puede parecer contrario a la intuición permitir que la columna de iones se expanda aún más antes de la extracción. La extracción retrasada es más bien una compensación del impulso inicial de los iones: proporciona los mismos tiempos de llegada al detector para iones con las mismas relaciones masa-carga pero con diferentes velocidades iniciales.
En la extracción retardada de iones producida al vacío, los iones que tienen menor impulso en la dirección de extracción comienzan a acelerarse a un mayor potencial debido a que están más lejos de la placa de extracción cuando se enciende el campo de extracción. Por el contrario, aquellos iones con mayor impulso hacia adelante comienzan a acelerarse a menor potencial ya que están más cerca de la placa de extracción. A la salida de la región de aceleración, los iones más lentos en la parte posterior de la columna serán acelerados a mayor velocidad que los iones inicialmente más rápidos en la parte frontal de la columna. Entonces, después de una extracción retrasada, un grupo de iones que abandona la fuente de iones antes tiene una velocidad menor en la dirección de la aceleración en comparación con algún otro grupo de iones que abandona la fuente de iones más tarde pero con mayor velocidad. Cuando los parámetros de la fuente de iones se ajustan correctamente, el grupo de iones más rápido alcanza al más lento a cierta distancia de la fuente de iones, por lo que la placa detectora colocada a esta distancia detecta la llegada simultánea de estos grupos de iones. La aplicación retrasada del campo de aceleración actúa a su manera como un elemento de enfoque unidimensional del tiempo de vuelo.
La distribución de energía cinética en la dirección de vuelo de los iones se puede corregir utilizando un reflectrón. [7] [8] El reflectrón utiliza un campo electrostático constante para reflejar el haz de iones hacia el detector. Los iones más energéticos penetran más profundamente en el reflectrón y recorren un camino ligeramente más largo hasta el detector. Los iones menos energéticos con la misma relación masa-carga penetran una distancia más corta en el reflectrón y, en consecuencia, toman un camino más corto hasta el detector. La superficie plana del detector de iones (típicamente una placa de microcanal , MCP) se coloca en el plano donde llegan al mismo tiempo iones del mismo m/z pero con diferentes energías contados con respecto al inicio del pulso de extracción en la fuente de iones. . Un punto de llegada simultánea de iones con la misma relación masa-carga pero con diferentes energías suele denominarse foco de tiempo de vuelo. Una ventaja adicional de la disposición re-TOF es que se logra el doble de trayectoria de vuelo en una longitud determinada del instrumento TOF.
Un obturador Bradbury-Nielsen es un tipo de puerta de iones utilizada en espectrómetros de masas TOF y en espectrómetros de movilidad iónica , así como en espectrómetros de masas TOF con transformada de Hadamard . [9] El obturador Bradbury-Nielsen es ideal para el selector de iones temporizado rápido (TIS), un dispositivo utilizado para aislar iones en un rango de masa estrecho en espectrómetros de masas MALDI en tándem (TOF/TOF). [10]
Las fuentes de iones continuas (más comúnmente ionización por electropulverización, ESI) generalmente están conectadas al analizador de masas TOF mediante "extracción ortogonal" en la que los iones introducidos en el analizador de masas TOF se aceleran a lo largo del eje perpendicular a su dirección de movimiento inicial. La aceleración ortogonal combinada con el enfriamiento de iones por colisión permite separar la producción de iones en la fuente de iones y el análisis de masa. En esta técnica, se puede lograr una resolución muy alta para iones producidos en fuentes MALDI o ESI. Antes de ingresar a la región de aceleración ortogonal o al pulsador, los iones producidos en fuentes continuas (ESI) o pulsadas (MALDI) se enfocan (enfrían) en un haz de 1 a 2 mm de diámetro mediante colisiones con un gas residual en guías multipolares de RF. Un sistema de lentes electrostáticas montadas en una región de alto vacío antes del pulsador hace que el haz sea paralelo para minimizar su divergencia en la dirección de aceleración. La combinación de enfriamiento por colisión de iones y aceleración ortogonal TOF [12] [13] ha proporcionado un aumento significativo en la resolución de los TOF MS modernos de unos pocos cientos a varias decenas de miles sin comprometer la sensibilidad.
La espectrometría de masas de tiempo de vuelo con transformada de Hadamard (HT-TOFMS) es un modo de análisis de masas que se utiliza para aumentar significativamente la relación señal-ruido de un TOFMS convencional. [14] Mientras que el TOFMS tradicional analiza un paquete de iones a la vez, esperando que los iones lleguen al detector antes de introducir otro paquete de iones, el HT-TOFMS puede analizar simultáneamente varios paquetes de iones que viajan en el tubo de vuelo. [15] Los paquetes de iones se codifican modulando rápidamente la transmisión del haz de iones, de modo que los iones más ligeros (y por lo tanto más rápidos) de todos los paquetes de masa liberados inicialmente por un haz se adelanten a los iones más pesados (y por lo tanto más lentos). [16] Este proceso crea una superposición de muchas distribuciones de tiempo de vuelo complicadas en forma de señales. Luego se utiliza el algoritmo de transformación de Hadamard para llevar a cabo el proceso de deconvolución que ayuda a producir una tasa de almacenamiento espectral de masas más rápida que el TOFMS tradicional y otros instrumentos de separación de masas comparables. [14]
El tiempo de vuelo en tándem ( TOF/TOF ) es un método de espectrometría de masas en tándem en el que se utilizan consecutivamente dos espectrómetros de masas de tiempo de vuelo. [17] [18] [19] [20] Para registrar el espectro completo de iones precursores (padres), TOF/TOF funciona en modo MS. En este modo, la energía del láser de pulso se elige ligeramente por encima del inicio de MALDI para una matriz específica en uso para garantizar el compromiso entre un rendimiento de iones para todos los iones originales y una fragmentación reducida de los mismos iones. Cuando se opera en modo tándem (MS/MS), la energía del láser aumenta considerablemente por encima del umbral MALDI. El primer espectrómetro de masas TOF (básicamente, un tubo de vuelo que termina con el selector de iones temporizado) aísla los iones precursores de elección usando un filtro de velocidad, típicamente, del tipo Bradbury-Nielsen, y el segundo TOF-MS (que incluye el post acelerador, tubo de vuelo, espejo de iones y detector de iones) analiza los iones fragmentados. Los iones fragmentados en MALDI TOF/TOF resultan de la desintegración de iones precursores excitados vibratoriamente por encima de su nivel de disociación en la fuente MALDI (desintegración posterior a la fuente [21] ). Se puede agregar al sistema una fragmentación de iones adicional implementada en una celda de colisión de alta energía para aumentar la tasa de disociación de iones precursores excitados por vibración. Algunos diseños incluyen extintores de señales precursoras como parte del segundo TOF-MS para reducir la carga de corriente instantánea en el detector de iones.
La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo (QToF-MS) tiene una configuración similar a un espectrómetro de masas en tándem con un cuadrupolo de resolución de masa y un hexapolo de celda de colisión, pero en lugar de un segundo cuadrupolo de resolución de masa, un cuadrupolo de tiempo de vuelo. Se utiliza el analizador. [22] [23] Ambos cuadrupolos pueden funcionar en modo RF solo para permitir que todos los iones pasen al analizador de masas con una fragmentación mínima. [22] Para aumentar el detalle espectral, el sistema aprovecha la disociación inducida por colisiones . Una vez que los iones llegan al tubo de vuelo, el pulsador de iones los envía hacia el reflector y de regreso al detector. Dado que el pulsador de iones transfiere la misma energía cinética a todas las moléculas, el tiempo de vuelo lo dicta la masa del analito.
QToF es capaz de medir masa hasta el cuarto decimal y se utiliza con frecuencia para análisis farmacéuticos y toxicológicos como método de detección de análogos de fármacos. [24] La identificación se realiza mediante la recopilación del espectro de masas y la comparación con bibliotecas de espectro de masas en tándem. [25]
Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOFMS) consta de un analizador de masas y un detector. Se utiliza una fuente de iones (ya sea pulsada o continua) para experimentos TOF relacionados con el laboratorio, pero no es necesaria para los analizadores TOF utilizados en el espacio, donde el sol o las ionosferas planetarias proporcionan los iones. El analizador de masas TOF puede ser un tubo de vuelo lineal o un reflectrón. El detector de iones normalmente consta de un detector de placa de microcanal o un multiplicador de emisión secundaria (SEM) rápido donde la primera placa convertidora ( dínodo ) es plana. [26] La señal eléctrica del detector se registra mediante un convertidor de tiempo a digital (TDC) o un convertidor rápido de analógico a digital (ADC). El TDC se utiliza principalmente en combinación con instrumentos TOF de aceleración ortogonal (oa).
Los convertidores de tiempo a digital registran la llegada de un solo ion en "contenedores" de tiempo discreto; una combinación de activación de umbral y discriminador de fracción constante (CFD) discrimina entre ruido electrónico y eventos de llegada de iones. CFD convierte pulsos eléctricos de forma gaussiana de nanosegundos de duración de diferentes amplitudes generados en el ánodo del MCP en pulsos de forma común (por ejemplo, pulsos compatibles con circuitos lógicos TTL/ESL) enviados al TDC. El uso de CFD proporciona un punto de tiempo correspondiente a una posición de pico máximo independiente de la variación en la amplitud del pico causada por la variación de la ganancia de MCP o SEM. Los CFD rápidos de diseños avanzados tienen tiempos muertos iguales o inferiores a dos tiempos de respuesta de un solo impacto del detector de iones (el tiempo de respuesta de un solo impacto para MCP con canales de 2 a 5 micrones de ancho puede estar entre 0,2 ns y 0,8 ns, dependiendo en el ángulo del canal) evitando así disparos repetitivos del mismo pulso. La resolución de doble impacto (tiempo muerto) del TDC de múltiples impactos moderno puede ser tan baja como 3-5 nanosegundos.
El TDC es un detector de conteo: puede ser extremadamente rápido (con una resolución de hasta unos pocos picosegundos), pero su rango dinámico es limitado debido a su incapacidad para contar adecuadamente los eventos cuando hay más de un ion simultáneamente (es decir, dentro del tiempo muerto del TDC). ) golpeó el detector. El resultado de un rango dinámico limitado es que el número de iones (eventos) registrados en un espectro de masas es menor en comparación con el número real. El problema del rango dinámico limitado se puede aliviar utilizando un diseño de detector multicanal: una serie de miniánodos conectados a una pila MCP común y múltiples CFD/TDC, donde cada CFD/TDC registra señales de un miniánodo individual. Para obtener picos con intensidades estadísticamente aceptables, el recuento de iones va acompañado de la suma de cientos de espectros de masas individuales (el llamado histograma). Para alcanzar una tasa de conteo muy alta (limitada únicamente por la duración del espectro TOF individual, que puede ser de hasta unos pocos milisegundos en configuraciones TOF de trayectorias múltiples), se utiliza una tasa de repetición muy alta de extracciones de iones al tubo TOF. Los analizadores de masas TOF de aceleración ortogonal comerciales suelen funcionar a velocidades de repetición de 5 a 20 kHz. En los espectros de masas combinados obtenidos sumando una gran cantidad de eventos de detección de iones individuales, cada pico es un histograma obtenido sumando los recuentos en cada contenedor individual. Debido a que el registro de la llegada de iones individuales con TDC produce solo un punto de tiempo, el TDC elimina la fracción del ancho del pico determinada por un tiempo de respuesta limitado tanto del detector MCP como del preamplificador. Esto se propaga hacia una mejor resolución masiva.
Los modernos convertidores analógicos a digitales ultrarrápidos de 10 GSample/seg digitalizan la corriente iónica pulsada del detector MCP en intervalos de tiempo discretos (100 picosegundos). El ADC moderno de 8 bits o 10 bits a 10 GHz tiene un rango dinámico mucho más alto que el TDC, lo que permite su uso en instrumentos MALDI-TOF con sus altas corrientes máximas. Para grabar señales analógicas rápidas de detectores MCP, es necesario hacer coincidir cuidadosamente la impedancia del ánodo del detector con el circuito de entrada del ADC ( preamplificador ) para minimizar el efecto de "timbre". La resolución de masas en espectros de masas registrados con ADC ultrarrápido se puede mejorar mediante el uso de detectores MCP de poros pequeños (2-5 micrones) con tiempos de respuesta más cortos.
La ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) es una técnica de ionización pulsada que es fácilmente compatible con TOF MS.
La tomografía con sonda atómica también aprovecha la espectrometría de masas TOF.
La espectroscopia de coincidencia de fotoiones y fotoelectrones utiliza fotoionización suave para la selección de energía interna de iones y espectrometría de masas TOF para análisis de masas.
La espectrometría de masas de iones secundarios suele utilizar espectrómetros de masas TOF para permitir la detección paralela de diferentes iones con un alto poder de resolución de masas.
Stefan Rutzinger propuso utilizar la espectrometría de masas TOF con un detector criogénico para la espectrometría de biomoléculas pesadas . [27]
En 1948, AE Cameron y DF Eggers Jr, que trabajaban en el Complejo de Seguridad Nacional Y-12 , descubrieron un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo temprano, llamado Velocitron. La idea había sido propuesta dos años antes, en 1946, por WE Stephens, de la Universidad de Pensilvania , en una sesión del viernes por la tarde de una reunión, en el Instituto Tecnológico de Massachusetts , de la Sociedad Estadounidense de Física . [28] [29]
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