La hibridación genómica comparativa ( CGH ) es un método citogenético molecular para analizar las variaciones del número de copias (CNV) en relación con el nivel de ploidía en el ADN de una muestra de prueba en comparación con una muestra de referencia, sin la necesidad de cultivar células. El objetivo de esta técnica es comparar rápida y eficientemente dos muestras de ADN genómico provenientes de dos fuentes, que a menudo están estrechamente relacionadas, porque se sospecha que contienen diferencias en términos de ganancias o pérdidas de cromosomas completos o regiones subcromosómicas . una porción de un cromosoma completo). Esta técnica se desarrolló originalmente para la evaluación de las diferencias entre los complementos cromosómicos del tumor sólido y el tejido normal, [1] y tiene una resolución mejorada de 5 a 10 megabases en comparación con las técnicas de análisis citogenético más tradicionales de bandas de Giemsa y fluorescencia in situ. hibridación (FISH) que están limitados por la resolución del microscopio utilizado. [2] [3]
Esto se logra mediante el uso de hibridación in situ con fluorescencia competitiva. En resumen, esto implica el aislamiento de ADN de las dos fuentes que se van a comparar, más comúnmente una fuente de prueba y una de referencia, el etiquetado independiente de cada muestra de ADN con fluoróforos (moléculas fluorescentes) de diferentes colores (generalmente rojo y verde), la desnaturalización de la ADN para que sea monocatenario, y la hibridación de las dos muestras resultantes en una proporción de 1:1 hasta una extensión metafásica normal de los cromosomas, a la que se unirán las muestras de ADN marcadas en su locus de origen. Utilizando un microscopio de fluorescencia y un software de computadora, las señales fluorescentes de colores diferenciales se comparan a lo largo de cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos fuentes. Una mayor intensidad del color de la muestra de prueba en una región específica de un cromosoma indica la ganancia de material de esa región en la muestra fuente correspondiente, mientras que una mayor intensidad del color de la muestra de referencia indica la pérdida de material en la muestra de prueba en ese cromosoma específico. región. Un color neutro (amarillo cuando las etiquetas del fluoróforo son rojas y verdes) indica que no hay diferencias entre las dos muestras en esa ubicación. [2] [3]
CGH sólo es capaz de detectar anomalías cromosómicas desequilibradas . Esto se debe a que las anomalías cromosómicas equilibradas, como las translocaciones recíprocas , las inversiones o los cromosomas en anillo, no afectan el número de copias, que es lo que detectan las tecnologías CGH. Sin embargo, la CGH permite la exploración de los 46 cromosomas humanos en una sola prueba y el descubrimiento de eliminaciones y duplicaciones, incluso a escala microscópica, lo que puede conducir a la identificación de genes candidatos que se explorarán más a fondo mediante otras técnicas citológicas. [2]
Mediante el uso de micromatrices de ADN junto con técnicas de CGH, se ha desarrollado la forma más específica de matriz CGH (aCGH), que permite una medida locus por locus de CNV con una resolución aumentada de hasta 100 kilobases . [4] [5] Esta técnica mejorada permite descubrir la etiología de enfermedades conocidas y desconocidas.
La motivación subyacente al desarrollo de CGH surgió del hecho de que las formas de análisis citogenético disponibles en ese momento ( bandas de Giemsa y FISH ) tenían un potencial de resolución limitado por los microscopios necesarios para la interpretación de los resultados que proporcionaban. Además, la interpretación de las bandas de Giemsa tiene el potencial de ser ambigua y, por lo tanto, tiene una confiabilidad menor, y ambas técnicas requieren una gran cantidad de mano de obra, lo que limita los loci que pueden examinarse. [4]
El primer informe sobre el análisis de CGH fue realizado por Kallioniemi y sus colegas en 1992 en la Universidad de California, San Francisco, quienes utilizaron CGH en el análisis de tumores sólidos. Lo lograron mediante la aplicación directa de la técnica tanto a líneas celulares de cáncer de mama como a tumores primarios de vejiga para establecer cariotipos con el número de copias completo de las células. Pudieron identificar 16 regiones diferentes de amplificación, muchas de las cuales fueron descubrimientos novedosos. [1]
Poco después, en 1993, du Manoir et al. informaron prácticamente la misma metodología. Los autores pintaron una serie de cromosomas humanos individuales de una biblioteca de ADN con dos fluoróforos diferentes en diferentes proporciones para probar la técnica, y también aplicaron CGH al ADN genómico de pacientes afectados con síndrome de Down o leucemia prolinfocítica de células T, así como a células de una línea celular de carcinoma papilar renal. Se concluyó que las proporciones de fluorescencia obtenidas eran precisas y que eran detectables diferencias entre el ADN genómico de diferentes tipos de células y, por tanto, que la CGH era una herramienta de análisis citogenético de gran utilidad. [6]
Inicialmente, el uso generalizado de la tecnología CGH fue difícil, ya que los protocolos no eran uniformes y, por lo tanto, surgieron inconsistencias, especialmente debido a incertidumbres en la interpretación de los datos. [3] Sin embargo, en 1994 se publicó una revisión que describía en detalle un protocolo de fácil comprensión [7] y el software de análisis de imágenes estuvo disponible comercialmente, lo que permitió que CGH se utilizara en todo el mundo. [3] A medida que nuevas técnicas como la microdisección y la reacción en cadena de la polimerasa cebada con oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR) estuvieron disponibles para la generación de productos de ADN, fue posible aplicar el concepto de CGH a anomalías cromosómicas más pequeñas y, por lo tanto, a la resolución de CGH. fue mejorado. [3]
La implementación de la matriz CGH, mediante la cual se utilizan micromatrices de ADN en lugar de la preparación tradicional de cromosomas en metafase, fue iniciada por Solinas-Tolodo et al. en 1997 utilizando células tumorales [8] y Pinkel et al. en 1998 mediante el uso de células de cáncer de mama. [9] Esto fue posible gracias al Proyecto Genoma Humano , que generó una biblioteca de fragmentos de ADN clonados con ubicaciones conocidas en todo el genoma humano , y estos fragmentos se utilizaron como sondas en el microarray de ADN. [10] Ahora se pueden utilizar sondas de diversos orígenes, como ADNc, productos de PCR genómicos y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), en micromatrices de ADN que pueden contener hasta 2 millones de sondas. [10] La matriz CGH está automatizada, permite una mayor resolución (hasta 100 kb) que la CGH tradicional, ya que las sondas son mucho más pequeñas que las preparaciones en metafase, requiere cantidades más pequeñas de ADN, pueden dirigirse a regiones cromosómicas específicas si es necesario y están ordenadas, por lo que más rápido de analizar, lo que lo hace mucho más adaptable a usos de diagnóstico. [10] [11]
El ADN de la diapositiva es una muestra de referencia y, por tanto, se obtiene de un hombre o una mujer cariotípicamente normal, aunque es preferible utilizar ADN femenino, ya que posee dos cromosomas X que contienen mucha más información genética que el cromosoma Y masculino. Se utilizan linfocitos de sangre periférica estimulados por fitohemaglutinina. Se añade 1 ml de sangre heparinizada a 10 ml de medio de cultivo y se incuba durante 72 horas a 37 °C en una atmósfera de CO 2 al 5 % . Se añade colchicina para detener las células en mitosis, luego las células se cosechan y se tratan con cloruro de potasio hipotónico y se fijan en metanol / ácido acético 3:1 . [3]
Luego se debe dejar caer una gota de la suspensión celular sobre un portaobjetos limpio con etanol desde una distancia de aproximadamente 30 cm; de manera óptima, esto se debe llevar a cabo a temperatura ambiente con niveles de humedad del 60 al 70 %. Los portaobjetos deben evaluarse mediante visualización utilizando un microscopio de contraste de fases, se debe observar un citoplasma mínimo y los cromosomas no deben superponerse y tener entre 400 y 550 bandas de largo sin cromátidas separadas y, finalmente, deben verse oscuros en lugar de brillantes. Luego, los portaobjetos deben secarse al aire durante la noche a temperatura ambiente y cualquier almacenamiento adicional debe realizarse en grupos de cuatro a -20 °C con perlas de sílice o nitrógeno presentes para mantener la sequedad. Se deben probar diferentes donantes ya que la hibridación puede ser variable. Se pueden utilizar portaobjetos disponibles comercialmente, pero siempre se deben probar primero. [3]
La extracción estándar con fenol se utiliza para obtener ADN de tejido de prueba o de referencia (individuo cariotípicamente normal), que implica la combinación de ácido tris - etilendiaminotetraacético y fenol con ADN acuoso en cantidades iguales. A esto le sigue la separación mediante agitación y centrifugación, después de lo cual la capa acuosa se elimina y se trata adicionalmente con éter y finalmente se usa precipitación con etanol para concentrar el ADN. [3]
Puede completarse utilizando kits de aislamiento de ADN disponibles comercialmente que se basan en columnas de afinidad . [3]
Preferiblemente, el ADN debe extraerse de tejido fresco o congelado, ya que será de la más alta calidad, aunque ahora es posible utilizar material de archivo fijado con formalina o embebido en cera de parafina, siempre que se sigan los procedimientos adecuados. 0,5-1 μg de ADN es suficiente para el experimento CGH, aunque si no se obtiene la cantidad deseada se puede aplicar DOP-PCR para amplificar el ADN; sin embargo, en este caso es importante aplicar DOP-PCR tanto a la prueba como a muestras de ADN de referencia para mejorar la confiabilidad. [3]
La traducción de Nick se utiliza para etiquetar el ADN e implica cortar el ADN y sustituir los nucleótidos marcados con fluoróforos (marcaje directo) o biotina u oxigenina para agregar anticuerpos conjugados con fluoróforos más tarde (marcaje indirecto). Entonces es importante comprobar las longitudes de los fragmentos del ADN de prueba y de referencia mediante electroforesis en gel , ya que deben estar dentro del rango de 500 kb-1500 kb para una hibridación óptima. [3]
Se agrega ADN Cot-1 de Unlabelled Life Technologies Corporation (ADN placentario enriquecido con secuencias repetitivas de 50 pb-100 pb de longitud) para bloquear secuencias de ADN repetitivas normales, particularmente en centrómeros y telómeros , ya que estas secuencias, si se detectan, pueden reducir la proporción de fluorescencia y causar ganancias o pérdidas para escapar a la detección. [3]
Se mezclan entre 8 y 12 μl de cada ADN de prueba marcado y de referencia etiquetado y se agregan 40 μg de ADN Cot-1, luego se precipita y posteriormente se disuelve en 6 μl de mezcla de hibridación, que contiene 50 % de formamida para disminuir la temperatura de fusión del ADN y 10 % de sulfato de dextrano. para aumentar la concentración efectiva de la sonda en una solución salina de citrato de sodio (SSC) a un pH de 7,0. [3]
La desnaturalización del portaobjetos y las sondas se realiza por separado. El portaobjetos se sumerge en formamida al 70%/2xSSC durante 5 a 10 minutos a 72 °C, mientras que las sondas se desnaturalizan mediante inmersión en un baño de agua de 80 °C durante 10 minutos y se agregan inmediatamente a la preparación del portaobjetos en metafase. Luego se cubre esta reacción con un cubreobjetos y se deja durante dos a cuatro días en una cámara húmeda a 40 °C. [3]
Luego se retira el cubreobjetos y se aplican lavados de 5 minutos, tres usando 2xSSC a temperatura ambiente, uno a 45 °C con 0,1xSSC y uno usando TNT a temperatura ambiente. Luego, la reacción se preincuba durante 10 minutos y luego sigue una incubación de 60 minutos a 37 °C, tres lavados más de 5 minutos con TNT y luego uno con 2xSSC a temperatura ambiente. Luego, el portaobjetos se seca usando una serie de etanol al 70%/96%/100% antes de teñir con DAPI (0,35 μg/ml), para la identificación de los cromosomas y se sella con un cubreobjetos. [3]
Para la visualización se requiere un microscopio de fluorescencia con los filtros apropiados para la tinción DAPI , así como los dos fluoróforos utilizados, y estos filtros también deben minimizar la interferencia entre los fluoróforos, como los filtros de paso de banda estrecha. El microscopio debe proporcionar una iluminación uniforme sin variación cromática , estar adecuadamente alineado y tener un objetivo tipo "plano" que sea apocromático y dé un aumento de x63 o x100. [3]
La imagen debe grabarse utilizando una cámara con una resolución espacial de al menos 0,1 μm al nivel de la muestra y proporcionar una imagen de al menos 600x600 píxeles. La cámara también debe poder integrar la imagen durante al menos 5 a 10 segundos, con una resolución fotométrica mínima de 8 bits. [3]
El software CGH dedicado está disponible comercialmente para el paso de procesamiento de imágenes y es necesario para restar el ruido de fondo, eliminar y segmentar materiales que no sean de origen cromosómico, normalizar la relación de fluorescencia, realizar cariotipos interactivos y escalar los cromosomas a una longitud estándar. Un "cariotipo de número relativo de copias" que presenta áreas cromosómicas de deleciones o amplificaciones se genera promediando las proporciones de una serie de metafases de alta calidad y representándolas a lo largo de un ideograma, un diagrama que identifica los cromosomas según patrones de bandas. La interpretación de los perfiles de ratio se realiza utilizando umbrales fijos o estadísticos ( intervalos de confianza ). Cuando se utilizan intervalos de confianza, se identifican ganancias o pérdidas cuando el 95% de la relación de fluorescencia no contiene 1,0. [3]
Se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación de cualquier paso que involucre ADN, especialmente con el ADN de la prueba, ya que la contaminación de la muestra con ADN normal distorsionará los resultados más cerca de 1,0, por lo que las anomalías pueden pasar desapercibidas. Se pueden emplear experimentos de FISH, PCR y citometría de flujo para confirmar los resultados. [4] [12]
La hibridación genómica comparativa de matrices (también hibridación genómica comparativa basada en microarrays, matriz CGH, matriz CGH, aCGH) es una técnica citogenética molecular para la detección de cambios en el número de copias cromosómicas en una escala de alta resolución y de todo el genoma. [13] Array CGH compara el genoma del paciente con un genoma de referencia e identifica diferencias entre los dos genomas y, por lo tanto, localiza regiones de desequilibrios genómicos en el paciente, utilizando los mismos principios de hibridación fluorescente in situ competitiva que el CGH tradicional.
Con la introducción del CGH de matriz, se supera la principal limitación del CGH convencional: la baja resolución. En la matriz CGH, los cromosomas en metafase se reemplazan por fragmentos de ADN clonados (+100–200 kb) cuya ubicación cromosómica exacta se conoce. Esto permite detectar aberraciones con más detalle y, además, permite mapear los cambios directamente en la secuencia genómica. [14]
Array CGH ha demostrado ser una técnica específica, sensible, rápida y de alto rendimiento, con ventajas considerables en comparación con otros métodos utilizados para el análisis de cambios en el número de copias de ADN, lo que la hace más adecuada para aplicaciones de diagnóstico. Con este método, se pueden detectar cambios en el número de copias a un nivel de 5 a 10 kilobases de secuencias de ADN. [15] A partir de 2006 [actualizar], incluso las matrices CGH (HR-CGH) de alta resolución son precisas para detectar variaciones estructurales (SV) con una resolución de 200 pb. [16] Este método permite identificar nuevos cambios cromosómicos recurrentes, como microdeleciones y duplicaciones en condiciones humanas, como cáncer y defectos de nacimiento debido a aberraciones cromosómicas.
Array CGH se basa en el mismo principio que el CGH convencional. En ambas técnicas, el ADN de una muestra de referencia (o control) y el ADN de una muestra de prueba (o de paciente) se marcan de manera diferencial con dos fluoróforos diferentes y se usan como sondas que se cohibridan competitivamente en objetivos de ácido nucleico . En la CGH convencional, el objetivo es una extensión de metafase de referencia. En la matriz CGH, estos objetivos pueden ser fragmentos genómicos clonados en una variedad de vectores (como BAC o plásmidos ), ADNc u oligonucleótidos . [17]
La Figura 2. [14] es una descripción esquemática de la técnica de matriz CGH. El ADN de la muestra que se va a analizar se marca con un fluoróforo rojo ( cianina 5) y una muestra de ADN de referencia se marca con un fluoróforo verde (cianina 3). Se mezclan cantidades iguales de las dos muestras de ADN y se cohibridan en una micromatriz de ADN de varios miles de fragmentos de ADN u oligonucleótidos clonados uniformemente espaciados, que se han localizado por triplicado en la matriz. Después de la hibridación, se utilizan sistemas de imágenes digitales para capturar y cuantificar las intensidades de fluorescencia relativas de cada uno de los fluoróforos hibridados. [17] La relación resultante de las intensidades de fluorescencia es proporcional a la relación del número de copias de las secuencias de ADN en los genomas de prueba y de referencia. Si las intensidades de los fluorocromos son iguales en una sonda, se interpreta que esta región del genoma del paciente tiene la misma cantidad de ADN en las muestras de prueba y de referencia; si hay una relación Cy3:Cy5 alterada, esto indica una pérdida o ganancia del ADN del paciente en esa región genómica específica. [18]
Array CGH se ha implementado utilizando una amplia variedad de técnicas. Por lo tanto, algunas de las ventajas y limitaciones de la matriz CGH dependen de la técnica elegida. Los enfoques iniciales utilizaron matrices producidas a partir de clones de ADN genómico con insertos grandes, como los BAC . El uso de BAC proporciona señales suficientemente intensas para detectar cambios en una sola copia y localizar con precisión los límites de aberración. Sin embargo, los rendimientos iniciales de ADN de clones BAC aislados son bajos y son necesarias técnicas de amplificación de ADN. Estas técnicas incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligación , la PCR con cebador degenerado utilizando uno o varios conjuntos de cebadores y la amplificación por círculo rodante . [19] También se pueden construir matrices utilizando ADNc. Actualmente, estas matrices producen una alta resolución espacial, pero la cantidad de ADNc está limitada por los genes codificados en los cromosomas y su sensibilidad es baja debido a la hibridación cruzada. [14] Esto da como resultado la incapacidad de detectar cambios en una sola copia a gran escala del genoma. [20] El último enfoque es detectar las matrices con oligonucleótidos cortos. La cantidad de oligos es casi infinita y el procesamiento es rápido, rentable y sencillo. Aunque los oligonucleótidos no tienen la sensibilidad para detectar cambios en una sola copia, el promedio de las proporciones de los oligonucleótidos que se asignan uno al lado del otro en el cromosoma puede compensar la sensibilidad reducida. [21] También es posible utilizar matrices que tengan sondas superpuestas para que se puedan descubrir puntos de interrupción específicos.
Hay dos enfoques para el diseño de microarrays para aplicaciones de CGH: genoma completo y dirigido.
Los conjuntos de genoma completo están diseñados para cubrir todo el genoma humano. A menudo incluyen clones que proporcionan una amplia cobertura en todo el genoma; y matrices que tienen cobertura contigua, dentro de los límites del genoma. Las matrices de genoma completo se han construido principalmente para aplicaciones de investigación y han demostrado su valor excepcional en el descubrimiento de genes. También son muy valiosos para detectar ganancias y pérdidas de ADN en el genoma con una resolución sin precedentes. [17]
Las matrices dirigidas están diseñadas para una región específica del genoma con el fin de evaluar ese segmento objetivo. Puede estar diseñado para estudiar un cromosoma o segmento cromosómico específico o para identificar y evaluar anomalías específicas en la dosis de ADN en individuos con sospecha de síndromes de microdeleción o reordenamientos subteloméricos. El objetivo crucial de un microarray dirigido en la práctica médica es proporcionar resultados clínicamente útiles para el diagnóstico, el asesoramiento genético, el pronóstico y el tratamiento clínico de anomalías citogenéticas desequilibradas. [17]
La CGH convencional se ha utilizado principalmente para la identificación de regiones cromosómicas que se pierden o ganan de forma recurrente en los tumores, así como para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. [22] Este enfoque también se puede utilizar para estudiar aberraciones cromosómicas en genomas fetales y neonatales . Además, la CGH convencional se puede utilizar para detectar anomalías cromosómicas y se ha demostrado que es eficaz en el diagnóstico de anomalías complejas asociadas con trastornos genéticos humanos. [14]
Los datos de CGH de varios estudios del mismo tipo de tumor muestran patrones consistentes de aberraciones genéticas no aleatorias. [23] Algunos de estos cambios parecen ser comunes a varios tipos de tumores malignos, mientras que otros son más específicos del tumor. Por ejemplo, las ganancias de las regiones cromosómicas lq, 3q y 8q, así como las pérdidas de 8p, 13q, 16q y 17p, son comunes a varios tipos de tumores, como el cáncer de mama, ovario, próstata, riñón y vejiga (Figura. 3). Otras alteraciones, como las ganancias de 12p y Xp en el cáncer testicular, la ganancia de 13q, la pérdida de 9q en el cáncer de vejiga, la pérdida de 14q en el cáncer renal y la pérdida de Xp en el cáncer de ovario, son más específicas y podrían reflejar las fuerzas de selección únicas que operan durante el desarrollo del cáncer en diferentes órganos. . [23] Array CGH también se utiliza con frecuencia en la investigación y el diagnóstico de neoplasias malignas de células B, como la leucemia linfocítica crónica.
Cri du Chat (CdC) es un síndrome causado por una deleción parcial del brazo corto del cromosoma 5. [24] Varios estudios han demostrado que la CGH convencional es adecuada para detectar la deleción, así como alteraciones cromosómicas más complejas. Por ejemplo, Levy et al. (2002) informaron de un bebé con un llanto felino, el sello distintivo de CdC, pero con un cariotipo indistinto. El análisis CGH reveló una pérdida de material cromosómico de 5p15.3, lo que confirma clínicamente el diagnóstico. Estos resultados demuestran que la CGH convencional es una técnica confiable para detectar aberraciones estructurales y, en casos específicos, puede ser más eficiente para diagnosticar anomalías complejas. [24]
Las aplicaciones de Array CGH están dirigidas principalmente a detectar anomalías genómicas en el cáncer. Sin embargo, la matriz CGH también es adecuada para el análisis de aberraciones en el número de copias del ADN que causan trastornos genéticos humanos. [14] Es decir, la matriz CGH se emplea para descubrir eliminaciones, amplificaciones, puntos de interrupción y anomalías de ploidía. El diagnóstico precoz es beneficioso para el paciente, ya que puede someterse a tratamientos y asesoramiento adecuados para mejorar su pronóstico. [10]
Las alteraciones y reordenamientos genéticos ocurren con frecuencia en el cáncer y contribuyen a su patogénesis. La detección de estas aberraciones mediante la matriz CGH proporciona información sobre la ubicación de genes cancerosos importantes y puede tener uso clínico en el diagnóstico, clasificación y pronóstico del cáncer. [17] Sin embargo, no todas las pérdidas de material genético son patogénicas, ya que parte del material de ADN se pierde fisiológicamente durante la reordenación de los subgenes de inmunoglobulinas. En un estudio reciente, se implementó la matriz CGH para identificar regiones de aberración cromosómica ( variación del número de copias ) en varios modelos de cáncer de mama en ratones, lo que llevó a la identificación de genes que cooperan durante la oncogénesis inducida por myc. [25]
Array CGH también se puede aplicar no sólo al descubrimiento de anomalías cromosómicas en el cáncer, sino también al seguimiento de la progresión de los tumores. La diferenciación entre lesiones metastásicas y leves también es posible mediante FISH una vez que se han identificado las anomalías mediante la matriz CGH. [5] [10]
El síndrome de Prader-Willi (PWS) es una anomalía estructural paterna que afecta a 15q11-13, mientras que una aberración materna en la misma región causa el síndrome de Angelman (AS). En ambos síndromes, la mayoría de los casos (75%) son el resultado de una eliminación de 3 a 5 Mb de la región crítica de PWS/AS. [26] Estas pequeñas aberraciones no se pueden detectar mediante citogenética o CGH convencional, pero se pueden detectar fácilmente utilizando CGH de matriz. Como prueba de principio Vissers et al. (2003) construyeron una matriz genómica amplia con una resolución de 1 Mb para detectar a tres pacientes con síndromes de microdeleción conocidos confirmados por FISH, incluido uno con SPW. En los tres casos, las anomalías, que oscilaban entre 1,5 y 2,9 Mb, se identificaron fácilmente. [27] Por lo tanto, se demostró que la matriz CGH es un enfoque específico y sensible para detectar aberraciones submicroscópicas.
Cuando se utilizan microarrays superpuestos, también es posible descubrir puntos de interrupción implicados en aberraciones cromosómicas.
Aunque todavía no es una técnica ampliamente empleada, el uso de CGH de matriz como herramienta para el cribado genético previo a la implantación se está convirtiendo en un concepto cada vez más popular. Tiene el potencial de detectar CNV y aneuploidía en óvulos, espermatozoides o embriones, lo que puede contribuir a que el embrión no se implante con éxito, a un aborto espontáneo o a afecciones como el síndrome de Down (trisomía 21). Esto hace que la matriz CGH sea una herramienta prometedora para reducir la incidencia de condiciones que alteran la vida y mejorar las tasas de éxito de los intentos de FIV . La técnica implica la amplificación del genoma completo a partir de una sola célula que luego se utiliza en el método de matriz CGH. También se puede utilizar en parejas que portan translocaciones cromosómicas , como translocaciones recíprocas equilibradas o translocaciones robertsonianas, que tienen el potencial de causar desequilibrios cromosómicos en su descendencia. [12] [28] [29]
Una desventaja principal de la CGH convencional es su incapacidad para detectar aberraciones cromosómicas estructurales sin cambios en el número de copias , como mosaicismo , translocaciones cromosómicas equilibradas e inversiones . CGH también sólo puede detectar ganancias y pérdidas en relación con el nivel de ploidía. [30] Además, las regiones cromosómicas con secuencias cortas de ADN repetitivas son muy variables entre individuos y pueden interferir con el análisis de CGH. [14] Por lo tanto, las regiones de ADN repetitivas como centrómeros y telómeros deben bloquearse con ADN repetitivo sin marcar (por ejemplo, ADN Cot1) y/o pueden omitirse del cribado. [31] Además, la resolución de la CGH convencional es un problema práctico importante que limita sus aplicaciones clínicas. Aunque la CGH ha demostrado ser una técnica útil y fiable en la investigación y el diagnóstico tanto del cáncer como de los trastornos genéticos humanos, sus aplicaciones implican sólo anomalías graves. Debido a la resolución limitada de los cromosomas en metafase, las aberraciones menores de 5 a 10 Mb no se pueden detectar utilizando CGH convencional. [23] Para la detección de tales anomalías, se requiere una técnica de alta resolución. Array CGH supera muchas de estas limitaciones. Array CGH se caracteriza por su alta resolución, su principal ventaja con respecto al CGH convencional. La resolución estándar varía entre 1 y 5 Mb, pero se puede aumentar hasta aproximadamente 40 kb complementando la matriz con clones adicionales. Sin embargo, como en el CGH convencional, la principal desventaja del CGH de matriz es su incapacidad para detectar aberraciones que no dan como resultado cambios en el número de copias y su capacidad limitada para detectar mosaicismo. [14] El nivel de mosaicismo que se puede detectar depende de la sensibilidad y la resolución espacial de los clones. En la actualidad, los reordenamientos presentes en aproximadamente el 50% de las células son el límite de detección. Para la detección de tales anomalías, aún se deben utilizar otras técnicas, como SKY (cariotipo espectral) o FISH. [32]