El primer aislamiento de ácido desoxirribonucleico (ADN) fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher . [1] La extracción de ADN es el proceso de aislar ADN de las células de un organismo aislado de una muestra, típicamente una muestra biológica como sangre, saliva o tejido. Implica abrir las células, eliminar proteínas y otros contaminantes y purificar el ADN para que esté libre de otros componentes celulares. El ADN purificado puede luego usarse para aplicaciones posteriores como PCR , [2] secuenciación o clonación . Actualmente, es un procedimiento rutinario en biología molecular o análisis forenses .
Este proceso se puede realizar de varias maneras, dependiendo del tipo de muestra y de la aplicación posterior. [3] Los métodos más comunes son: lisis mecánica, química y enzimática, precipitación, purificación y concentración. El método específico utilizado para extraer el ADN, como la extracción con fenol-cloroformo, la precipitación con alcohol o la purificación a base de sílice. [4]
Para el método químico se utilizan muchos kits diferentes para la extracción, y seleccionar el correcto ahorrará tiempo en la optimización del kit y en los procedimientos de extracción. Se considera que la detección de sensibilidad por PCR muestra la variación entre los kits comerciales. [5]
Existen muchos métodos diferentes para extraer ADN, pero algunos pasos comunes incluyen:
Se pueden utilizar algunas variaciones de estos pasos según el protocolo específico de extracción de ADN. Además, existen algunos kits disponibles comercialmente que incluyen reactivos y protocolos diseñados específicamente para un tipo específico de muestra. [6]
La extracción de ADN es frecuentemente un paso preliminar en muchos procedimientos de diagnóstico utilizados para identificar virus y bacterias ambientales y diagnosticar enfermedades y enfermedades hereditarias. Estos métodos incluyen, entre otros:
La técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se desarrolló en la década de 1980. La idea básica es utilizar una sonda de ácido nucleico para hibridar el ADN nuclear de células en interfase o cromosomas en metafase adheridos a un portaobjetos de microscopio. Es un método molecular que se utiliza, entre otras cosas, para reconocer y contar grupos bacterianos particulares. [1]
Para reconocer, definir y cuantificar los patrones geográficos y temporales en las comunidades de bacterioplancton marino, los investigadores emplean una técnica llamada polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP).
Secuenciación: Genomas completos o parciales y otros componentes cromosómicos, terminados para comparación con secuencias previamente publicadas.
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Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN se pueden eliminar añadiendo una proteasa o precipitando las proteínas con acetato de sodio o de amonio o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN.
Después del aislamiento, el ADN se disuelve en un tampón ligeramente alcalino, normalmente en un tampón TE , o en agua ultrapura .
Los productos químicos más comunes utilizados para la extracción de ADN incluyen:
Algunos de los métodos de extracción de ADN más comunes incluyen la extracción orgánica , la extracción Chelex y la extracción en fase sólida . [8] Estos métodos producen ADN aislado de manera consistente, pero difieren tanto en la calidad como en la cantidad de ADN producido. Al seleccionar un método de extracción de ADN, hay múltiples factores a considerar, incluidos el costo, el tiempo, la seguridad y el riesgo de contaminación.
La extracción orgánica implica la adición de incubación en múltiples soluciones químicas diferentes; [8] incluyendo un paso de lisis , una extracción con fenol-cloroformo, una precipitación con etanol y pasos de lavado. La extracción orgánica se utiliza a menudo en los laboratorios porque es barata y produce grandes cantidades de ADN puro. Aunque es fácil, hay muchos pasos involucrados y lleva más tiempo que otros métodos. También implica el uso desfavorable de los productos químicos tóxicos fenol y cloroformo , y existe un mayor riesgo de contaminación debido a la transferencia de ADN entre múltiples tubos. [9] Varios protocolos basados en la extracción orgánica de ADN se desarrollaron de manera efectiva hace décadas, [10] aunque también se han desarrollado y publicado versiones mejoradas y más prácticas de estos protocolos en los últimos años. [11]
El método de extracción Chelex implica agregar la resina Chelex a la muestra, hervir la solución, luego agitarla y centrifugarla. Los materiales celulares se unen a las perlas Chelex, mientras que el ADN está disponible en el sobrenadante . [9] El método Chelex es mucho más rápido y simple que la extracción orgánica, y solo requiere un tubo, lo que disminuye el riesgo de contaminación del ADN. Desafortunadamente, la extracción Chelex no produce tanta cantidad y el ADN producido es monocatenario, lo que significa que solo se puede usar para análisis basados en PCR y no para RFLP . [9]
La extracción en fase sólida, como el uso de un método de extracción basado en columna de centrifugación, aprovecha el hecho de que el ADN se une a la sílice . La muestra que contiene ADN se agrega a una columna que contiene gel de sílice o perlas de sílice y sales caotrópicas . Las sales caotrópicas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre las hebras y facilitan la unión del ADN a la sílice al hacer que los ácidos nucleicos se vuelvan hidrófobos. Esto expone los residuos de fosfato para que estén disponibles para la adsorción. [12] El ADN se une a la sílice, mientras que el resto de la solución se lava con etanol para eliminar las sales caotrópicas y otros componentes innecesarios. [8] Luego, el ADN se puede rehidratar con soluciones acuosas bajas en sal que permiten la elución del ADN de las perlas.
Este método produce ADN de alta calidad, en gran parte de doble cadena, que se puede utilizar tanto para análisis de PCR como de RFLP . Este procedimiento se puede automatizar [9] y tiene un alto rendimiento, aunque menor que el método de fenol-cloroformo . Este es un método de un solo paso, es decir, todo el procedimiento se completa en un tubo. Esto reduce el riesgo de contaminación, lo que lo hace muy útil para la extracción forense de ADN. Diferentes empresas fabrican y comercializan múltiples kits comerciales de extracción en fase sólida; el único problema es que son más caros que la extracción orgánica o la extracción con Chelex.
Para aislar el ADN de algunas muestras se deben elegir técnicas específicas. Las muestras típicas con aislamiento de ADN complicado son:
El ADN extracromosómico generalmente es fácil de aislar, especialmente los plásmidos pueden aislarse fácilmente mediante lisis celular seguida de precipitación de proteínas, que atrapa el ADN cromosómico en la fracción insoluble y después de la centrifugación, el ADN plasmídico puede purificarse de la fracción soluble.
La extracción de ADN mediante Hirt es el aislamiento de todo el ADN extracromosómico de una célula de mamífero. El proceso de extracción mediante Hirt elimina el ADN nuclear de alto peso molecular y deja solo el ADN mitocondrial de bajo peso molecular y los episomas virales presentes en la célula.
Un indicador de difenilamina (DPA) confirmará la presencia de ADN. Este procedimiento implica la hidrólisis química del ADN: cuando se calienta (por ejemplo, a ≥95 °C) en ácido, la reacción requiere un azúcar desoxirribosa y, por lo tanto, es específica para el ADN. En estas condiciones, la 2-desoxirribosa se convierte en w-hidroxilevulinil aldehído, que reacciona con el compuesto, difenilamina, para producir un compuesto de color azul. La concentración de ADN se puede determinar midiendo la intensidad de absorbancia de la solución a 600 nm con un espectrofotómetro y comparándola con una curva estándar de concentraciones de ADN conocidas.
La medición de la intensidad de la absorbancia de la solución de ADN a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm se utiliza como medida de la pureza del ADN. El ADN se puede cuantificar cortándolo con una enzima de restricción , pasándolo por un gel de agarosa , tiñéndolo con bromuro de etidio (EtBr) o con un colorante diferente y comparando la intensidad del ADN con un marcador de ADN de concentración conocida.
Mediante la técnica Southern blot , este ADN cuantificado se puede aislar y examinar más a fondo mediante análisis PCR y RFLP . Estos procedimientos permiten la diferenciación de las secuencias repetidas dentro del genoma. Son estas técnicas las que utilizan los científicos forenses para la comparación, la identificación y el análisis.
En este método, los núcleos de las plantas se aíslan moliendo físicamente los tejidos y reconstituyendo los núcleos intactos en un tampón de aislamiento nuclear (NIB) único. Los ADN de los plástidos se liberan de los orgánulos y se eliminan con un tampón osmótico mediante lavado y centrifugación. A continuación, los núcleos purificados se lisan y se limpian aún más mediante extracción orgánica, y el ADN genómico se precipita con una alta concentración de CTAB. El ADN genómico de alto peso molecular y alta pureza se extrae de los núcleos, se disuelve en un tampón de alto pH, lo que permite un almacenamiento estable a largo plazo. [14]
El almacenamiento de ADN es un aspecto importante de los proyectos de extracción de ADN, ya que garantiza la integridad y estabilidad del ADN extraído para aplicaciones posteriores. [15]
Un método común de almacenamiento de ADN es la precipitación con etanol, que implica agregar etanol y una sal, como cloruro de sodio o acetato de potasio, al ADN extraído para precipitarlo de la solución. Luego, el ADN se sedimenta mediante centrifugación y se lava con etanol al 70 % para eliminar cualquier contaminante restante. Luego, el sedimento de ADN se seca al aire y se resuspende en un tampón, como el tampón Tris-EDTA (TE), para su almacenamiento.
Otro método consiste en congelar el ADN en un tampón como el tampón TE o en un crioprotector como el glicerol o el DMSO, a -20 o -80 grados Celsius. Este método preserva la integridad del ADN y ralentiza la actividad de las enzimas que pueden degradarlo.
Es importante tener en cuenta que la elección del tampón y las condiciones de almacenamiento dependerán de la aplicación posterior a la que se destine el ADN. Por ejemplo, si el ADN se va a utilizar para PCR, se puede almacenar en un tampón TE a 4 grados Celsius, mientras que si se va a utilizar para un almacenamiento o envío a largo plazo, se puede almacenar en etanol a -20 grados Celsius. El ADN extraído debe comprobarse periódicamente para comprobar su calidad e integridad, por ejemplo, mediante una electroforesis en gel o una espectrofotometría. También se deben anotar y controlar las condiciones de almacenamiento, como la temperatura y la humedad.
También es importante tener en cuenta la estabilidad a largo plazo del ADN y el potencial de degradación con el tiempo. El ADN extraído debe conservarse durante el menor tiempo posible y las condiciones de almacenamiento deben elegirse de forma que se minimice el riesgo de degradación.
En general, el ADN extraído debe almacenarse en las mejores condiciones posibles para garantizar su estabilidad e integridad para aplicaciones posteriores.
Existen varias técnicas de control de calidad que se utilizan para garantizar la calidad del ADN extraído, entre ellas: [16]
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