Coeficiente sincrónico de alteración de la resistencia

Secuencia de lapso de tiempo que muestra ADN pUC19 teñido con SYBR Green I (2,7 kb) que se concentra con SCODA en el centro de un gel de agarosa al 1 % (donde no hay ningún electrodo presente).

El coeficiente de alteración de arrastre sincrónico ( SCODA ) es un método biotecnológico para purificar, separar y/o concentrar biomoléculas. SCODA tiene la capacidad de separar moléculas cuya movilidad (o arrastre) se puede alterar en sincronía con un campo impulsor. Esta técnica se ha utilizado principalmente para concentrar y purificar ADN , donde la movilidad del ADN cambia con un campo electroforético aplicado . ^{[1] [2] [3]} El SCODA electroforético también se ha demostrado con ARN y proteínas .

Teoría

Como se muestra a continuación, el principio SCODA se aplica a cualquier partícula impulsada por un campo de fuerza en el que la movilidad de la partícula se altera en sincronía con el campo impulsor.

Principio SCODA

Para fines explicativos, consideremos una partícula electroforética que se mueve (se impulsa) en un campo eléctrico. Sea:

${\displaystyle E={\widehat {E}}E_{0}cos(\omega t)}$ (1)

y ${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}}$

${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=\mu cos(\omega t){\widehat {E}}E_{0}}$(2)

denota un campo eléctrico y la velocidad de la partícula en dicho campo. Si es constante el promedio temporal de . ${\displaystyle \mu }$ ${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=0}$

Si no es constante en función del tiempo y si tiene un componente de frecuencia proporcional al promedio temporal, no necesita ser cero. ${\displaystyle \mu }$ ${\displaystyle \mu }$ ${\displaystyle cos(\omega t)}$ ${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)}$

Consideremos el siguiente ejemplo:

${\displaystyle \mu (t)=\mu _{0}+\mu _{1}cos(\omega t)}$(3)

Sustituyendo (3) en (2) y calculando el promedio de tiempo, , obtenemos: ${\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}}$

${\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}={\frac {1}{2}}\mu _{1}{\widehat {E}}E_{0}}$(4)

De esta forma, es posible que la partícula experimente una velocidad media temporal distinta de cero, en otras palabras, una deriva electroforética neta, incluso cuando la media temporal del campo eléctrico aplicado sea cero.

Creación de la geometría del campo de enfoque

Consideremos una partícula bajo un campo de fuerza que tiene una velocidad paralela a la dirección del campo y una velocidad proporcional al cuadrado de la magnitud del campo eléctrico (se puede emplear cualquier otra no linealidad ^[1] ):

${\displaystyle {\overrightarrow {v}}=k{\widehat {E}}(E)^{2}}$(5)

La movilidad efectiva de la partícula (la relación entre pequeños cambios en la velocidad de deriva con respecto a pequeños cambios en el campo eléctrico ) se puede expresar en coordenadas cartesianas como: ${\displaystyle d{\overrightarrow {v}}}$ ${\displaystyle d{\overrightarrow {E}}}$

${\displaystyle dv_{x}={\partial v_{x} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{x} \over \partial E_{y}}dE_{y}}$(6)

${\displaystyle dv_{y}={\partial v_{y} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{y} \over \partial E_{y}}dE_{y}}$(7)

Combinando (5), (6) y (7) obtenemos:

${\displaystyle dv_{x}=k{\Biggl [}{\Biggl (}E+{\frac {E_{x}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}}$(8)

${\displaystyle dv_{y}=k{\Biggl [}{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}E+{\frac {E_{y}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}}$(9)

Consideremos además que el campo E se aplica en un plano y gira en sentido antihorario a una frecuencia angular , de modo que los componentes del campo son: ${\displaystyle \omega }$

${\displaystyle E_{x}=Ecos(\omega t)}$(10)

${\displaystyle E_{y}=Esin(\omega t)}$(11)

Sustituyendo (10) y (11) en (8) y (9) y simplificando mediante identidades trigonométricas se obtiene una suma de términos constantes, seno y coseno, en la frecuencia angular . Los cálculos siguientes se realizarán de manera que solo los términos coseno en la frecuencia angular produzcan una velocidad de deriva neta distinta de cero; por lo tanto, solo necesitamos evaluar estos términos, que se abreviarán y . Se obtiene lo siguiente: ${\displaystyle 2\omega }$ ${\displaystyle 2\omega }$ ${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}}$ ${\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}}$

${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{x}}$(12)

${\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{y}}$(13)

Sea y tome la forma de un pequeño campo cuadrupolar de intensidad que varía de manera sinusoidal proporcional a tal que: ${\displaystyle dE_{x}}$ ${\displaystyle dE_{y}}$ ${\displaystyle dE_{q}}$ ${\displaystyle cos(2\omega t)}$

${\displaystyle dE_{x}=-dE_{q}xcos(\omega t)}$(14)

${\displaystyle dE_{y}=dE_{q}ycos(\omega t)}$(15)

Sustituyendo (14) y (15) en (12) y (13) y tomando el promedio del tiempo obtenemos:

${\displaystyle {\bar {dv_{x}}}={\bar {dv_{x_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}x}$(16)

${\displaystyle {\bar {dv_{y}}}={\bar {dv_{y_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}y}$(17)

que puede resumirse en notación vectorial como:

${\displaystyle {\bar {d{\overrightarrow {v}}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}{\overrightarrow {r}}}$(18)

La ecuación (18) muestra que para todas las posiciones la velocidad promedio en el tiempo está en la dirección hacia el origen (concentrando las partículas hacia el origen), con una velocidad proporcional al coeficiente de movilidad k, la fuerza del campo rotatorio E y la fuerza del campo cuadrupolo perturbador . ${\displaystyle {\overrightarrow {r}}}$ ${\displaystyle dE_{q}}$

Concentración y purificación de ADN

Concentración de ADN mediante SCODA con el sistema Aurora. A: inyección de la muestra de ADN. B, C, D: purificación de la muestra de ADN. En la imagen D, el ADN alcanza una posición de equilibrio entre la fuerza de concentración de SCODA y el campo de lavado de CC. E: muestra de ADN enfocada lista para ser pipeteada desde el pocillo de extracción central.

Las moléculas de ADN son únicas porque son polímeros largos y cargados que, cuando se encuentran en un medio de separación, como un gel de agarosa , pueden exhibir perfiles de velocidad altamente no lineales en respuesta a un campo eléctrico. Como tal, el ADN se separa fácilmente de otras moléculas que no están cargadas y son fuertemente no lineales, utilizando SCODA ^[2].

Inyección de ADN

Para realizar la concentración SCODA de moléculas de ADN, la muestra debe estar embebida en el medio de separación (gel) en lugares donde el campo electroforético tenga una intensidad óptima. Esta translocación inicial de la muestra a la posición de concentración óptima se denomina "inyección". La posición óptima está determinada por la geometría del gel y la ubicación de los electrodos de accionamiento SCODA. Inicialmente, la muestra se encuentra en una solución tampón en la cámara de muestra, adyacente al gel de concentración. La inyección se logra mediante la aplicación de un campo electroforético de CC controlado a través de la cámara de muestra, lo que da como resultado que todas las partículas cargadas se transfieran al gel de concentración. Para obtener un buen apilamiento de la muestra (es decir, una banda de ADN apretada), se pueden emplear múltiples métodos. Un ejemplo es explotar la relación de conductividad entre el tampón de la cámara de muestra y el tampón del gel de concentración. Si el tampón de la cámara de muestra tiene una conductividad baja y el tampón del gel de concentración tiene una conductividad alta, esto da como resultado una caída brusca del campo eléctrico en la interfaz gel-tampón, lo que promueve el apilamiento.

Concentración de ADN

Una vez que el ADN se encuentra en la posición óptima en el gel de concentración, se aplican los campos rotatorios SCODA. La frecuencia de los campos se puede ajustar de modo que solo se concentren longitudes específicas de ADN. Para evitar la ebullición durante la etapa de concentración debido al calentamiento Joule, el medio de separación se puede enfriar activamente. También es posible invertir la fase de los campos SCODA, de modo que las moléculas se desenfoquen.

Purificación del ADN

Como solo las partículas que exhiben una velocidad no lineal experimentan la fuerza de concentración de SCODA, las partículas pequeñas cargadas que responden linealmente a los campos electroforéticos no se concentran. Estas partículas, en lugar de girar en espiral hacia el centro del gel SCODA, orbitan en un radio constante. Si se superpone un campo de CC débil a los campos giratorios de SCODA, estas partículas se "lavarán" del gel SCODA, lo que dará como resultado que el ADN altamente puro permanezca en el centro del gel.

Extracción de ADN

La fuerza del ADN de SCODA hace que la muestra de ADN se concentre en el centro del gel SCODA. Para extraer el ADN se puede preformar un pocillo de extracción en el gel y llenarlo con tampón. Como el ADN no experimenta una movilidad no lineal en el tampón, se acumula en el pocillo de extracción. Al final de la etapa de concentración y purificación, la muestra se puede extraer con una pipeta de este pocillo.

Aplicaciones

A - Muestra altamente contaminada antes de ser inyectada en el gel SCODA. B - Gel SCODA después de la inyección. C - Gel SCODA durante el proceso de purificación. D - Gel SCODA al final del proceso de purificación (sin contaminantes visibles). E - Imagen fluorescente del gel SCODA de la imagen D que muestra ADN teñido en el centro del gel SCODA.

Purificación de ADN de alto peso molecular

La fuerza electroforética SCODA es lo suficientemente suave como para mantener la integridad del ADN de alto peso molecular, ya que se concentra hacia el centro del gel SCODA. Según la longitud del ADN de la muestra, se pueden utilizar diferentes protocolos para concentrar ADN de más de 1 Mb de longitud.

Purificación de ADN contaminado

La concentración y purificación de ADN se ha logrado directamente a partir de muestras de arenas bituminosas resuspendidas en un tampón utilizando la técnica SCODA. Posteriormente se realizó la secuenciación de ADN y se han identificado tentativamente más de 200 genomas bacterianos distintos. ^{[2] [4]} SCODA también se ha utilizado para la purificación de ADN de muchas otras fuentes ambientales. ^{[5] [6]}

Específico de la secuencia

El ADN mutante (verde) se separa del ADN de tipo salvaje (rojo) durante el SCODA específico de secuencia.

La movilidad no lineal del ADN en gel se puede controlar aún más incorporando en el gel SCODA oligonucleótidos de ADN complementarios a los fragmentos de ADN de la muestra. ^{[7] [8]} Esto da como resultado velocidades no lineales altamente específicas para el ADN de la muestra que coincide con el ADN incorporado en el gel. Esta no linealidad específica artificial se utiliza luego para concentrar selectivamente solo las secuencias de interés y rechazar todas las demás secuencias de ADN de la muestra. Se ha demostrado un enriquecimiento de más de 1.000.000 de veces de variantes de un solo nucleótido con respecto al tipo salvaje.

Una aplicación de esta técnica es la detección de ADN derivado de tumores raros ( ctDNA ) a partir de muestras de sangre. ^[9]

Véase también

• Extracción de ADN
• Precipitación de etanol
• Extracción con fenol-cloroformo
• Purificación basada en columna de centrifugación

Referencias

1. Marziali, Andre; Pel, Joel; Bizzotto, Dan; Whitehead, Lorne A. (1 de enero de 2005). "Nuevo mecanismo de electroforesis basado en perturbación de arrastre alternante sincrónica". Electroforesis . 26 (1): 82–90. doi :10.1002/elps.200406140. ISSN  0173-0835. PMID  15624147. S2CID  12381185.
2. Pel, Joel; Broemeling, David; Mai, Laura; Poon, Hau-Ling; Tropini, Giorgia; Warren, René L.; Holt, Robert A.; Marziali, Andre (1 de septiembre de 2009). "La respuesta electroforética no lineal produce un parámetro único para la separación de biomoléculas". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 106 (35): 14796–14801. Bibcode :2009PNAS..10614796P. doi : 10.1073/pnas.0907402106 . ISSN  0027-8424. PMC 2728113 . PMID  19706437. 
3. Joel, Pel (2009). Un nuevo mecanismo electroforético y parámetro de separación para la concentración selectiva de ácidos nucleicos basado en el coeficiente sincrónico de alteración de arrastre (SCODA) (Tesis). Universidad de Columbia Británica. doi :10.14288/1.0067696. hdl :2429/13402.
4. Voordouw, Gerrit. "Descubrimiento de la diversidad microbiana de las arenas petrolíferas de Alberta a través de la metagenómica: un paso adelante para una mejor recuperación de petróleo y soluciones ambientales" (PDF) . Genome Alberta . Consultado el 20 de abril de 2016 .
5. Engel, Katja; Pinnell, Lee; Cheng, Jiujun; Charles, Trevor C.; Neufeld, Josh D. (1 de enero de 2012). "Electroforesis no lineal para la purificación de ADN del suelo para metagenómica". Journal of Microbiological Methods . 88 (1): 35–40. doi :10.1016/j.mimet.2011.10.007. PMID  22056233. S2CID  10726081.
6. Charlop-Powers, Zachary; Milshteyn, Aleksandr; Brady, Sean F (2014). "Métodos metagenómicos de descubrimiento de moléculas pequeñas". Current Opinion in Microbiology . 19 : 70–75. doi :10.1016/j.mib.2014.05.021. PMC 4135586 . PMID  25000402. 
7. Thompson, Jason D.; Shibahara, Gosuke; Rajan, Sweta; Pel, Joel; Marziali, Andre (15 de febrero de 2012). "Selección de ADN para secuencias raras: enriquecimiento basado en secuencias altamente específicas y metilación". PLOS ONE . ​​7 (2): e31597. Bibcode :2012PLoSO...731597T. doi : 10.1371/journal.pone.0031597 . ISSN  1932-6203. PMC 3280224 . PMID  22355378. 
8. Donald, Thompson, Jason (2011). Una técnica basada en el coeficiente sincrónico de alteración de arrastre (SCODA) para el enriquecimiento específico de secuencias de ácidos nucleicos (Tesis). Universidad de Columbia Británica. doi :10.14288/1.0071663. hdl :2429/33073.{{cite thesis}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
9. Kidess, Evelyn; Heirich, Kyra; Wiggin, Matthew; Vysotskaia, Valentina; Visser, Brendan C.; Marziali, Andre; Wiedenmann, Bertram; Norton, Jeffrey A.; Lee, Mark (10 de febrero de 2015). "Perfiles de mutación del ADN tumoral del plasma y el tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal con una nueva plataforma de detección de mutaciones multiplexada de alta sensibilidad". Oncotarget . 6 (4): 2549–2561. doi :10.18632/oncotarget.3041. ISSN  1949-2553. PMC 4385870 . PMID  25575824.