El análisis isotópico por resonancia magnética nuclear permite cuantificar con gran precisión las diferencias de contenido isotópico en cada sitio de una molécula y medir así el fraccionamiento isotópico natural específico para cada sitio de esta molécula. El método analítico SNIF-NMR fue desarrollado para detectar el (sobre)azucarado del vino y el enriquecimiento de los mostos de uva , y se utiliza principalmente para verificar la autenticidad de los productos alimenticios (como vinos , licores , jugos de frutas , miel , azúcar y vinagre ) y para controlar la naturalidad de algunas moléculas aromáticas (como vainillina , benzaldehído , cetona de frambuesa y anetol ). El método SNIF-NMR ha sido adoptado por la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) y la Unión Europea como método oficial para el análisis del vino. También es un método oficial adoptado por la Asociación de Químicos Analíticos (AOAC) para el análisis de jugos de frutas, jarabe de arce , vainillina, y por el Comité Europeo de Normalización (CEN) para el vinagre.
La OIV lo adopta como método oficial
→ Implementación del método SNIF-NMR para laboratorios oficiales en Europa
→ Implementación del método SNIF-NMR< para laboratorios oficiales en EE.UU.
→ Implementación del método SNIF-NMR para laboratorios oficiales en Asia
Los átomos de hidrógeno , oxígeno y carbono coexisten naturalmente en proporciones específicas con sus isótopos estables , 2H (o D), 18O y 13C respectivamente, en diferentes proporciones como se muestra en la figura 2 a continuación.
La cantidad y distribución de los diferentes isótopos en una molécula está influenciada por: [5]
Este fenómeno se conoce como fraccionamiento isotópico natural (véase la Figura 3). La huella isotópica resultante puede proporcionar información sobre el origen (botánico, sintético, geográfico) de la molécula o producto.
El principio del SNIF-NMR se basa en el “Fraccionamiento Isotópico Natural”. Habitualmente, para la autenticidad de los alimentos, se utilizan dos núcleos:
La RMN-SNIF se aplica a moléculas puras (o purificadas). Por lo tanto, pueden ser necesarios algunos pasos de preparación en el laboratorio antes del análisis. Por ejemplo, para la RMN-SNIF del etanol, según los métodos oficiales:
En cada paso del análisis SNIF-RMN se deben tomar medidas para evitar el fraccionamiento isotópico parásito. En cada muestra se realizan medidas de control como la determinación del grado alcohólico de los productos intermedios del análisis (jugo fermentado o destilado).
Las proporciones isotópicas de una molécula también se pueden determinar mediante espectrometría de masas de proporción isotópica (IRMS), la cantidad de muestra para IRMS es mucho menor que para RMN, y existe la posibilidad de acoplar el espectrómetro de masas a un sistema cromatográfico para permitir la purificación en línea o análisis de varios componentes de una mezcla compleja. Sin embargo, la muestra se quema después de una transformación física como la combustión o la pirólisis . Por lo tanto, da un valor medio de la concentración del isótopo estudiado entre todos los sitios de la molécula. IRMS es la técnica oficial de la AOAC utilizada para la proporción media 13 C/ 12 C (o δ 13 C) de azúcares o etanol, y el método oficial CEN y OIV para el 18O/16O en agua .
El método SNIF-RMN (Site-Specific Natural Isotope Fractionation study by Nuclear Magnetic Resonance) permite determinar con un alto nivel de precisión las proporciones isotópicas para cada uno de los sitios de la molécula, lo que permite una mejor discriminación. Por ejemplo, para el etanol (CH 3 CH 2 OH), se pueden obtener las tres proporciones ((D/H)CH 3 , (D/H)CH 2 y (D/H) OH ).
Método oficial de la AOAC para detectar la adición de azúcar en un jugo de fruta [4] o en el jarabe de arce. Es el único método confiable para detectar la adición de azúcar C3 (p. ej.: azúcar de remolacha ).
Las moléculas de etanol obtenidas tras la fermentación completa del azúcar coexisten con tres isotopómeros monodeuterados naturales (CH 2 D-CH 2 -OH, CH 3 -CHDOH y CH 3 -CH 2 OD), cuya presencia puede cuantificarse con relativa precisión. [6]
En el siguiente espectro de RMN 2H (Figura 8), un pico corresponde a uno de los tres isotopómeros del etanol observados. En el método oficial de la AOAC, las proporciones de (D/H)CH 3 y (D/H)CH 2 se calculan mediante comparación con un estándar interno, la tetrametilurea (TMU), con un valor (D/H) certificado.
La siguiente Figura 9 resume el principio de interpretación de:
Los valores obtenidos en una muestra de prueba se comparan luego con los valores de muestras auténticas (Base de datos).
La SNIF-RMN es el método oficial de la OIV para determinar la autenticidad del origen del vino. Es el único método que permite detectar la adición de azúcares C3 (como el azúcar de remolacha).
Los parámetros isotópicos tanto del agua como del etanol están relacionados con la humedad y la temperatura de la región de crecimiento de la planta . Por lo tanto, la consideración de los datos meteorológicos de la región y del año ayuda a realizar un diagnóstico. En el caso del vino y las frutas, se ha demostrado que los parámetros isotópicos del etanol responden incluso a variaciones ambientales sutiles y caracterizan eficientemente la región de producción. [6] [7]
Desde 1991, en el Centro Común de Investigación de la Comisión Europea (CE-CCI) se ha creado un banco de datos isotópicos sobre vinos de todos los miembros europeos. La base de datos contiene varios miles de entradas de vinos europeos [8] y se mantiene y actualiza cada año. Esta base de datos es accesible para todos los laboratorios públicos oficiales. Las empresas privadas que participan en los controles de alimentos y bebidas también han recogido muestras auténticas y han creado bancos de datos específicos. [9]
De esta manera, comparando el fraccionamiento isotópico natural específico correspondiente a cada sitio de una molécula de etanol de vino con el de una molécula conocida y referenciada en una base de datos, se puede comprobar el origen geográfico, botánico y de producción de la molécula de etanol y, por tanto, la autenticidad del vino. [10]
El origen de los vinagres obtenidos por oxidación bacteriana o química del etanol resultante de la fermentación de diversos azúcares se puede identificar mediante la técnica de RMN 2 H-SNIF. Permite controlar la calidad del vinagre y determinar si procede de caña de azúcar, vino, malta, sidra y alcohol o de una síntesis química. [11]
2 H-SNIF-NMR es el método oficial de la AOAC para determinar la vainillina natural.
La abundancia de cinco isotopómeros monodeuterados de vainillina se puede medir mediante RMN 2 H-SNIF. La molécula de vainillina se representa en la figura 11; todos los sitios observables para los que se pueden medir las concentraciones de deuterio específicas del sitio están referenciados con un número.
En cuanto al vino o la fruta, la interpretación de los resultados en términos de origen se realiza mediante la comparación de los parámetros isotópicos de la muestra analizada con los de un grupo de moléculas de referencia de origen conocido. Parece que todos los orígenes de la vainillina se discriminan bien utilizando los datos de RMN de 2 H. En particular, la vainillina ex-vaina se puede distinguir bien de las otras fuentes, como podemos ver en la figura 12 a continuación.
Además, este método es el único que permite discriminar entre fuentes naturales y biosintéticas de vainillina. [12]
La naturalidad de diferentes aromas también se puede comprobar mediante SNIF-NMR: por ejemplo, para el anetol, la abundancia de solo seis isotopómeros monodeuterados se puede medir mediante 2 H-SNIF-NMR que permite diferenciar los orígenes botánicos del hinojo, el anís estrellado o el pino. [13]
Otras aplicaciones: La SNIF-RMN aplicada al benzaldehído permite detectar aceites adulterados de almendras amargas y canela . Está demostrado que los contenidos de deuterio sitio-específicos del benzaldehído permiten determinar el origen de la molécula: sintético (ex- tolueno y ex- cloruro de benzal ), natural (ex-pepitas de albaricoque , melocotón , cereza y ex-almendra amarga) y semisintético (ex- cinamaldehído extraído de la canela). [14] También se han publicado otras aplicaciones: cetona de frambuesa), [15] heliotropina, ...
Como se describe en el trabajo de E. Tenailleau y S. Akoka, una optimización de los parámetros técnicos ha permitido alcanzar una mejor precisión en las mediciones de RMN de 13 C). [16]
El método 13 C-SNIF-NMR se denomina método “nueva frontera” porque es el primer método analítico que puede diferenciar azúcares provenientes de plantas de metabolismo C4 (caña, maíz, etc.) y algunas plantas de metabolismo ácido crasuláceo (metabolismo CAM) como la piña o el agave . [17]
Este método también se puede aplicar a los productos de tequila , donde puede diferenciar el auténtico tequila 100% de agave, el tequila misto (elaborado con al menos 51% de agave) y los productos elaborados con una mayor proporción de azúcar de caña o maíz y, por lo tanto, que no cumplen con la definición legal de tequila. [17]
Este método seguramente tendrá más aplicaciones en el futuro, en el campo del análisis de autenticidad de alimentos y bebidas.
