La oxidación del ADN es el proceso de daño oxidativo del ácido desoxirribonucleico . Como lo describen en detalle Burrows et al., [1] la 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) es la lesión oxidativa más común observada en el ADN dúplex porque la guanina tiene un potencial de reducción de un electrón menor que los otros nucleósidos en el ADN. Los potenciales de reducción de un electrón de los nucleósidos (en voltios frente a NHE ) son guanina 1,29, adenina 1,42, citosina 1,6 y timina 1,7. Aproximadamente 1 de cada 40.000 guaninas en el genoma están presentes como 8-oxo-dG en condiciones normales. Esto significa que pueden existir >30.000 8-oxo-dG en un momento dado en el genoma de una célula humana. Otro producto de la oxidación del ADN es el 8-oxo-dA. La 8-oxo-dA se produce aproximadamente con 1/10 de la frecuencia de la 8-oxo-dG. [2] El potencial de reducción de la guanina puede reducirse hasta en un 50%, dependiendo de los nucleósidos vecinos particulares apilados junto a ella dentro del ADN.
La oxidación excesiva del ADN está relacionada con ciertas enfermedades y cánceres, [3] mientras que los niveles normales de nucleótidos oxidados, debido a los niveles normales de ROS , pueden ser necesarios para la memoria y el aprendizaje. [4] [5]
En 2003, Cooke et al. [6] identificaron más de 20 lesiones de bases de ADN dañadas por oxidación, que se superponen a las 12 bases oxidadas descritas en 1992 por Dizdaroglu. [7] Dos de las bases oxidadas más frecuentemente encontradas por Dizdaroglu después de la radiación ionizante (que causa estrés oxidativo) fueron los dos productos de oxidación de la guanina que se muestran en la figura. Uno de estos productos fue 8-OH-Gua (8-hidroxiguanina). (El artículo 8-oxo-2'-desoxiguanosina se refiere a la misma base dañada, ya que la forma ceto 8-oxo-Gua descrita allí puede sufrir un cambio tautomérico a la forma enólica 8-OH-Gua que se muestra aquí). El otro producto fue FapyGua (2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina). Otro producto de oxidación frecuente fue 5-OH-Hyd (5-hidroxihidantoína) derivada de la citosina.
La mayoría de las bases oxidadas son eliminadas del ADN por enzimas que operan dentro de la vía de reparación por escisión de bases. [6] La eliminación de bases oxidadas en el ADN es bastante rápida. Por ejemplo, la 8-oxo-dG aumentó 10 veces en los hígados de ratones sometidos a radiación ionizante, pero el exceso de 8-oxo-dG se eliminó con una vida media de 11 minutos. [8]
Los niveles de estado estacionario de daños endógenos del ADN representan el equilibrio entre la formación y la reparación. Swenberg et al. [9] midieron las cantidades promedio de daños endógenos del ADN en estado estacionario en células de mamíferos. Los siete daños más comunes que encontraron se muestran en la Tabla 1. Solo una base directamente oxidada, 8-hidroxiguanina , a aproximadamente 2400 8-OH-G por célula, estaba entre los daños del ADN más frecuentes presentes en el estado estacionario.
Como analizaron Valavanidis et al. [11], los niveles elevados de 8-oxo-dG en un tejido pueden servir como biomarcador del estrés oxidativo. También observaron que los niveles elevados de 8-oxo-dG se asocian con frecuencia a la carcinogénesis y la enfermedad.
En la figura que se muestra en esta sección, el epitelio colónico de un ratón con una dieta normal tiene un nivel bajo de 8-oxo-dG en sus criptas colónicas (panel A). Sin embargo, un ratón que probablemente esté experimentando tumorigénesis colónica (debido al desoxicolato agregado a su dieta [10] ) tiene un nivel alto de 8-oxo-dG en su epitelio colónico (panel B). El desoxicolato aumenta la producción intracelular de oxígeno reactivo, lo que resulta en un mayor estrés oxidativo, [12] [13] y esto puede contribuir a la tumorigénesis y carcinogénesis. De 22 ratones alimentados con la dieta suplementada con desoxicolato , 20 (91%) desarrollaron tumores colónicos después de 10 meses con la dieta, y los tumores en 10 de estos ratones (45% de los ratones) incluyeron un adenocarcinoma (cáncer). [10] Cooke et al. [6] señalan que varias enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer y el lupus eritematoso sistémico, tienen niveles elevados de 8-oxo-dG pero no un aumento de carcinogénesis.
Valavanidis et al. [11] señalaron que el daño oxidativo del ADN, como el 8-oxo-dG, puede contribuir a la carcinogénesis mediante dos mecanismos. El primer mecanismo implica la modulación de la expresión génica, mientras que el segundo es a través de la inducción de mutaciones.
La alteración epigenética, por ejemplo, mediante la metilación de islas CpG en una región promotora de un gen, puede reprimir la expresión del gen (véase metilación del ADN en el cáncer ). En general, la alteración epigenética puede modular la expresión génica. Como revisaron Bernstein y Bernstein, [14] la reparación de varios tipos de daños en el ADN puede, con baja frecuencia, dejar restos de los diferentes procesos de reparación y, por lo tanto, causar alteraciones epigenéticas. 8-oxo-dG se repara principalmente mediante reparación por escisión de bases (BER). [15] Li et al. [16] revisaron estudios que indicaban que una o más proteínas BER también participan en alteraciones epigenéticas que involucran metilación, desmetilación o reacciones del ADN acopladas a la modificación de histonas. Nishida et al. [17] examinaron los niveles de 8-oxo-dG y también evaluaron la metilación del promotor de 11 genes supresores de tumores (TSG) en 128 muestras de biopsia de hígado. Estas biopsias se tomaron de pacientes con hepatitis C crónica, una enfermedad que causa daños oxidativos en el hígado. Entre los 5 factores evaluados, solo los niveles elevados de 8-oxo-dG se correlacionaron en gran medida con la metilación del promotor de los TSG (p<0,0001). Esta metilación del promotor podría haber reducido la expresión de estos genes supresores de tumores y haber contribuido a la carcinogénesis .
Yasui et al. [18] examinaron el destino de 8-oxo-dG cuando este derivado oxidado de desoxiguanosina se insertó en el gen de la timidina quinasa en un cromosoma dentro de células linfoblastoides humanas en cultivo. Insertaron 8-oxo-dG en aproximadamente 800 células y pudieron detectar los productos que se produjeron después de la inserción de esta base alterada, según lo determinado a partir de los clones producidos después del crecimiento de las células. 8-oxo-dG se restauró a G en el 86% de los clones, probablemente reflejando una reparación precisa por escisión de bases o síntesis de translesión sin mutación. Las transversiones de G:C a T:A ocurrieron en el 5,9% de los clones, deleciones de una sola base en el 2,1% y transversiones de G:C a C:G en el 1,2%. Juntas, estas mutaciones más comunes totalizaron el 9,2% del 14% de las mutaciones generadas en el sitio de la inserción de 8-oxo-dG. Entre las otras mutaciones en los 800 clones analizados, también se encontraron 3 deleciones mayores, de tamaños 6, 33 y 135 pares de bases. Por lo tanto, el 8-oxo-dG, si no se repara, puede causar directamente mutaciones frecuentes, algunas de las cuales pueden contribuir a la carcinogénesis .
Como revisaron Wang et al., [19] la guanina oxidada parece tener múltiples funciones reguladoras en la expresión génica. Como observaron Wang et al., [19] los genes propensos a transcribirse activamente están densamente distribuidos en regiones del genoma con alto contenido de GC. Luego describieron tres modos de regulación génica por oxidación del ADN en guanina. En un modo, parece que el estrés oxidativo puede producir 8-oxo-dG en un promotor de un gen. El estrés oxidativo también puede inactivar OGG1. El OGG1 inactivo, que ya no escinde 8-oxo-dG, sin embargo se dirige y forma complejos con 8-oxo-dG, y causa una curva pronunciada (~70 o ) en el ADN. Esto permite el ensamblaje de un complejo de iniciación transcripcional, que regula positivamente la transcripción del gen asociado. La base experimental que establece este modo también fue revisada por Seifermann y Epe [20].
Un segundo modo de regulación génica por oxidación del ADN en una guanina, [19] [21] ocurre cuando se forma un 8-oxo-dG en una secuencia formadora de G-cuadrúplex (PQS) rica en guanina en la cadena codificante de un promotor, después de lo cual OGG1 activo escinde el 8-oxo-dG y genera un sitio apurínico/apirimidínico (sitio AP). El sitio AP permite la fusión del dúplex para desenmascarar el PQS, adoptando un pliegue de G-cuadrúplex (estructura/motivo G4) que tiene un papel regulador en la activación de la transcripción.
Un tercer modo de regulación génica por oxidación del ADN en una guanina, [19] ocurre cuando 8-oxo-dG se compleja con OGG1 y luego recluta remodeladores de cromatina para modular la expresión génica. La proteína de unión al ADN 4 de la helicasa de cromodominio (CHD4) , un componente del complejo (NuRD) , es reclutada por OGG1 a sitios de daño oxidativo del ADN. Luego, CHD4 atrae enzimas metiladoras de ADN e histonas que reprimen la transcripción de genes asociados.
Seifermann y Epe [20] observaron que la inducción altamente selectiva de 8-oxo-dG en las secuencias promotoras observadas en la inducción de la transcripción puede ser difícil de explicar como consecuencia del estrés oxidativo general. Sin embargo, parece haber un mecanismo para la generación dirigida al sitio de bases oxidadas en las regiones promotoras. Perillo et al., [22] [23] demostraron que la histona desmetilasa LSD1 específica de lisina genera una explosión local de especies reactivas de oxígeno (ROS) que induce la oxidación de nucleótidos cercanos cuando lleva a cabo su función. Como ejemplo específico, después del tratamiento de células con un estrógeno, LSD1 produjo H 2 O 2 como subproducto de su actividad enzimática. Se demostró que la oxidación del ADN por LSD1 durante la desmetilación de la histona H3 en la lisina 9 es necesaria para el reclutamiento de OGG1 y también de la topoisomerasa IIβ a la región promotora de bcl-2 , un gen sensible al estrógeno, y el posterior inicio de la transcripción.
8-oxo-dG no se produce aleatoriamente en el genoma. En fibroblastos embrionarios de ratón , se encontró un enriquecimiento de 2 a 5 veces de 8-oxo-dG en regiones de control genético, incluidos promotores , regiones 5'-no traducidas y regiones 3'-no traducidas en comparación con los niveles de 8-oxo-dG encontrados en cuerpos de genes y en regiones intergénicas . [24] En células endoteliales de la arteria pulmonar de rata, cuando se examinaron 22.414 genes codificadores de proteínas para ubicaciones de 8-oxo-dG, la mayoría de los 8-oxo-dG (cuando estaban presentes) se encontraron en regiones promotoras en lugar de dentro de cuerpos de genes. [25] Entre cientos de genes cuyos niveles de expresión se vieron afectados por la hipoxia, aquellos con promotores 8-oxo-dG recién adquiridos se regularon positivamente , y aquellos genes cuyos promotores perdieron 8-oxo-dG se regularon negativamente casi todos . [25]
La oxidación de la guanina, particularmente dentro de los sitios CpG , puede ser especialmente importante en el aprendizaje y la memoria. La metilación de las citosinas ocurre en el 60-90% de los sitios CpG dependiendo del tipo de tejido. [26] En el cerebro de los mamíferos, ~62% de los CpG están metilados. [26] La metilación de los sitios CpG tiende a silenciar genes de manera estable. [27] Más de 500 de estos sitios CpG están desmetilados en el ADN neuronal durante la formación y consolidación de la memoria en las regiones del hipocampo [28] [29] y la corteza cingulada [29] del cerebro. Como se indica a continuación, el primer paso en la desmetilación de la citosina metilada en un sitio CpG es la oxidación de la guanina para formar 8-oxo-dG.
La primera figura de esta sección muestra un sitio CpG donde la citosina se metila para formar 5-metilcitosina (5mC) y la guanina se oxida para formar 8-oxo-2'-desoxiguanosina (en la figura, esto se muestra en la forma tautomérica 8-OHdG). Cuando se forma esta estructura, la enzima de reparación por escisión de bases OGG1 se dirige a 8-OHdG y se une a la lesión sin escisión inmediata. OGG1, presente en un sitio 5mCp-8-OHdG recluta a TET1 , y TET1 oxida el 5mC adyacente al 8-OHdG. Esto inicia la desmetilación de 5mC. [30] TET1 es una enzima clave involucrada en la desmetilación de 5mCpG. Sin embargo, TET1 solo puede actuar sobre 5mCpG si la guanina se oxidó primero para formar 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG o su tautómero 8-oxo-dG), lo que da como resultado un dinucleótido 5mCp-8-OHdG (ver la primera figura de esta sección). [30] Esto inicia la vía de desmetilación en la citosina metilada, que finalmente da como resultado una citosina no metilada, que se muestra en la segunda figura de esta sección.
Se ha establecido que la expresión alterada de proteínas en las neuronas, debido a cambios en la metilación del ADN (probablemente controlada por la desmetilación dependiente de 8-oxo-dG de los sitios CpG en los promotores de genes dentro del ADN de las neuronas) es central para la formación de la memoria. [32]
Raza et al. [33] analizaron la evidencia de que el daño del ADN inducido por estrés oxidativo desempeña un papel en el trastorno bipolar . Los pacientes bipolares tienen niveles elevados de daños en las bases del ADN inducidos por oxidación incluso durante períodos de estado mental estable. [34] El nivel de la enzima de reparación por escisión de bases OGG1 que elimina ciertas bases oxidadas del ADN también se reduce en comparación con los individuos sanos. [34]
El trastorno depresivo mayor se asocia con un aumento del daño oxidativo del ADN. [33] Los aumentos en las modificaciones oxidativas de purinas y pirimidinas en pacientes depresivos pueden deberse a una reparación deficiente de los daños oxidativos del ADN. [35]
Los estudios post mortem de pacientes ancianos con esquizofrenia crónica mostraron que el daño oxidativo del ADN aumenta en la región del hipocampo del cerebro. [36] La proporción media de neuronas con la base de ADN oxidada 8-oxo-dG fue 10 veces mayor en pacientes con esquizofrenia que en individuos de comparación. Raza et al. [33] y Markkanen et al. [37] han revisado la evidencia que indica un papel del daño oxidativo del ADN en la esquizofrenia.
Los ARN en el medio nativo están expuestos a varias agresiones. Entre estas amenazas, el estrés oxidativo es una de las principales causas de daño a los ARN. El nivel de estrés oxidativo que soporta una célula se refleja en la cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS se generan a partir del metabolismo normal del oxígeno en las células y se reconocen como una lista de moléculas activas, como O 2 •− , 1 O 2 , H 2 O 2 y, •OH . [38] Un ácido nucleico puede ser oxidado por ROS a través de una reacción de Fenton . [39] Hasta la fecha, se han descubierto alrededor de 20 lesiones oxidativas en el ADN. [40] Es probable que los ARN sean más sensibles a las ROS por las siguientes razones: i) la estructura básicamente monocatenaria expone más sitios a las ROS; ii) en comparación con el ADN nuclear, los ARN están menos compartimentados; iii) los ARN se distribuyen ampliamente en las células no solo en el núcleo como lo hacen los ADN, sino también en grandes porciones en el citoplasma. [41] [42] Esta teoría ha sido apoyada por una serie de descubrimientos en hígados de ratas, leucocitos humanos , etc. En realidad, monitorear un sistema aplicando la etiqueta isotópica [ 18 O]-H 2 O 2 muestra una mayor oxidación en el ARN celular que en el ADN. La oxidación daña aleatoriamente los ARN, y cada ataque trae problemas al metabolismo celular normal. Aunque la alteración de la información genética en el ARNm es relativamente rara, la oxidación en los ARNm in vitro e in vivo da como resultado una baja eficiencia de traducción y productos proteicos aberrantes. [43] Aunque la oxidación golpea las cadenas nucleicas aleatoriamente, residuos particulares son más susceptibles a las ROS, y estos sitios calientes son golpeados por ROS a una tasa alta. Entre todas las lesiones descubiertas hasta ahora, una de las más abundantes en el ADN y el ARN es la 8-hidroxiguanina. [44] Además, la 8-hidroxiguanina es la única medible entre todas las lesiones del ARN. Además de su abundancia, la 8-hidroxidesoxiguanosina (8-oxodG) y la 8-hidroxiguanosina (8-oxoG) se identifican como las lesiones de oxidación más perjudiciales por su efecto mutagénico, [45] en el que esta contraparte no canónica puede emparejarse defectuosamente tanto con la adenina como con la citosina con la misma eficiencia. [46] [47]Este emparejamiento incorrecto provoca la alteración de la información genética a través de la síntesis de ADN y ARN. En el ARN, los niveles de oxidación se estiman principalmente a través de ensayos basados en 8-oxoG. Hasta ahora, los enfoques desarrollados para medir directamente el nivel de 8-oxoG incluyen análisis basados en HPLC y ensayos que emplean anticuerpos monoclonales anti-8-oxoG. El método basado en HPLC mide 8-oxoG con un detector electroquímico (ECD) y G total con un detector UV . [48] La relación que resulta de comparar los dos números proporciona el grado en que se oxida el G total. El anticuerpo monoclonal anti-8-oxoG de ratón se aplica ampliamente para detectar directamente este residuo en secciones de tejido o membrana, lo que ofrece una forma más visual de estudiar su distribución en los tejidos y en subconjuntos discretos de ADN o ARN. Las técnicas indirectas establecidas se basan principalmente en las consecuencias mutagénicas de esta lesión, como el ensayo lacZ. [49] Este método fue creado y descrito por primera vez por Taddei y fue una herramienta potencialmente poderosa para comprender la situación de oxidación tanto a nivel de secuencia de ARN como a nivel de nucleótido único. Otra fuente de ARN oxidado es la incorporación incorrecta de la contraparte oxidada de nucleótidos individuales. De hecho, el tamaño del conjunto de precursores de ARN es cientos de veces mayor que el del ADN.
Se han producido intensos debates sobre si existe realmente el problema del control de calidad del ARN. Sin embargo, con la preocupación de las distintas duraciones de las vidas medias de las diversas especies de ARN, que van desde varios minutos hasta horas, la degradación del ARN defectuoso ya no se puede atribuir fácilmente a su carácter transitorio. De hecho, la reacción con ROS tarda sólo unos minutos, lo que es incluso más corto que la vida media de los ARN más inestables. [41] Si añadimos el hecho de que el ARN estable supone la mayor parte del ARN total, la eliminación de errores de ARN se convierte en algo hipercrítico y ya no debería descuidarse. Esta teoría se sustenta en el hecho de que el nivel de ARN oxidado disminuye tras la eliminación del desafío oxidativo. [50] [51] Algunos factores potenciales incluyen las ribonucleasas , que se sospecha que degradan selectivamente los ARN dañados bajo estrés. También se sabe que las enzimas que trabajan a nivel del grupo de precursores de ARN controlan la calidad de la secuencia de ARN cambiando el precursor de error a la forma que no se puede incluir directamente en la cadena naciente.