El circuito de retroalimentación de transcripción-traducción ( TTFL , por sus siglas en inglés) es un modelo celular para explicar los ritmos circadianos en el comportamiento y la fisiología . El TTFL, ampliamente conservado en todas las especies, es autorregulador, en el que la transcripción de los genes del reloj está regulada por sus propios productos proteicos.
Los ritmos circadianos se han documentado durante siglos. Por ejemplo, el astrónomo francés Jean-Jacques d'Ortous de Mairan observó el movimiento periódico de 24 horas de las hojas de la planta Mimosa ya en 1729. Sin embargo, la ciencia recién ha comenzado a descubrir los mecanismos celulares responsables de impulsar los ritmos circadianos observados. La base celular de los ritmos circadianos está respaldada por el hecho de que se han observado ritmos en organismos unicelulares [1].
A principios de la década de 1970, los experimentos realizados por Ron Konopka y sus colegas, en los que se utilizaron métodos genéticos directos para inducir mutaciones, revelaron que los especímenes de Drosophila melanogaster con genes de período ( Per ) alterados también demostraron una periodicidad alterada. A medida que mejoraron las herramientas experimentales de genética y biología molecular, los investigadores identificaron más genes involucrados en el mantenimiento de un comportamiento rítmico normal, lo que dio lugar al concepto de que los ritmos internos son modificados por un pequeño subconjunto de genes centrales del reloj. Hardin y sus colegas (1990) fueron los primeros en proponer que el mecanismo que impulsa estos ritmos era un bucle de retroalimentación negativa. Los descubrimientos posteriores importantes confirmaron este modelo; en particular, los experimentos dirigidos por Thomas K. Darlington y Nicholas Gekakis a fines de la década de 1990 que identificaron proteínas del reloj y caracterizaron sus métodos en Drosophila y ratones, respectivamente. Estos experimentos dieron lugar al modelo de bucle de retroalimentación de transcripción-traducción (TTFL) que ahora se ha convertido en el paradigma dominante para explicar el comportamiento circadiano en una amplia gama de especies. [2]
El TTFL es un bucle de retroalimentación negativa , en el que los genes del reloj están regulados por sus productos proteicos. En general, el TTFL implica dos brazos principales: elementos reguladores positivos que promueven la transcripción y productos proteicos que suprimen la transcripción. Cuando un elemento regulador positivo se une a un promotor del gen del reloj , la transcripción procede, lo que resulta en la creación de una transcripción de ARNm , y luego procede la traducción , lo que resulta en un producto proteico. Hay retrasos característicos entre la acumulación de transcripción de ARNm, la acumulación de proteínas y la supresión genética debido a la dinámica de la traducción, la modificación postraduccional de proteínas , la dimerización de proteínas y el viaje intracelular al núcleo . [3] En todas las especies, las proteínas involucradas en el TTFL contienen motivos estructurales comunes como los dominios PAS , involucrados en las interacciones proteína-proteína, y los dominios bHLH , involucrados en la unión del ADN. [4]
Una vez que se acumulan suficientes productos proteicos modificados en el citoplasma , se transportan al núcleo, donde inhiben el elemento positivo del promotor para detener la transcripción de los genes del reloj. De este modo, el gen del reloj se transcribe a niveles bajos hasta que sus productos proteicos se degradan, lo que permite que los elementos reguladores positivos se unan al promotor y reinicien la transcripción. El ciclo de retroalimentación negativa del TTFL tiene múltiples propiedades importantes para el reloj circadiano celular. En primer lugar, da lugar a ritmos diarios tanto en la transcripción génica como en la abundancia y el tamaño de las proteínas, causados por el retraso entre la traducción y la regulación negativa del gen. El período del ciclo, o el tiempo necesario para completar un ciclo, permanece constante en cada individuo y, salvo mutación, suele ser de cerca de 24 horas. Esto permite un arrastre estable al ciclo de luz-oscuridad de 24 horas que experimenta la Tierra. Además, los productos proteicos de los genes del reloj controlan genes posteriores que no forman parte del ciclo de retroalimentación, lo que permite que los genes del reloj creen ritmos diarios en otros procesos, como el metabolismo, dentro del organismo. [3] Por último, el TTFL es un ciclo límite, lo que significa que es un bucle cerrado que volverá a su trayectoria fija incluso si se ve perturbado, manteniendo la trayectoria oscilatoria en su período fijo de 24 horas. [5]
La presencia del TTFL está muy conservada en las distintas especies animales; sin embargo, muchos de los actores involucrados en el proceso han cambiado a lo largo del tiempo evolutivo en diferentes especies. Existen diferencias en los genes y proteínas involucrados en el TTFL al comparar plantas, animales, hongos y otros eucariotas. Esto sugiere que un reloj que sigue el modelo TTFL ha evolucionado varias veces durante la existencia de la vida. [6]
El TTFL se descubrió por primera vez en Drosophila y el sistema comparte varios componentes con el TTFL de los mamíferos. La transcripción de los genes del reloj, Period (per) y Timeless (tim) , se inicia cuando los elementos positivos Cycle (dCYC) y Clock (dCLK) forman un heterodímero y se unen a los promotores E-box , iniciando la transcripción. Durante el día, TIM se degrada; la exposición a la luz facilita la unión de CRY a TIM, lo que conduce a la ubiquitinación de TIM y su eventual degradación. [7] Durante la noche, TIM y PER pueden formar heterodímeros y acumularse lentamente en el citoplasma, donde PER es fosforilado por la quinasa DOUBLETIME (DBT). La modificación postranscripcional de múltiples grupos fosfato apunta al complejo para su degradación y facilita la localización nuclear. En el núcleo, el dímero PER-TIM se une al dímero CYC-CLK, lo que hace que el dímero CYC-CLK se libere de las cajas E e inhibe la transcripción. Una vez que PER y TIM se degradan, los dímeros CYC-CLK pueden unirse nuevamente a las cajas E para iniciar la transcripción, cerrando así el ciclo de retroalimentación negativa. [8]
Los bucles de retroalimentación secundarios interactúan con este bucle de retroalimentación primario. CLOCKWORK ORANGE (CWO) se une a las cajas E para actuar como un competidor directo de CYC-CLK, inhibiendo así la transcripción. PAR-DOMAIN PROTEIN 1 ε (PDP1ε) es un activador de retroalimentación y VRILLE (VRI) es un inhibidor de retroalimentación del promotor Clk, y su expresión es activada por dCLK-dCYC. La proteína 75 inducida por ecdisona (E75) inhibe la expresión de clk y activa de forma dependiente del tiempo la transcripción de pe r. Todos estos bucles secundarios actúan para reforzar el TTFL primario. [8]
El criptocromo en Drosophila es un fotorreceptor de luz azul que desencadena la degradación de TIM, lo que indirectamente conduce al restablecimiento de la fase del reloj y a la renovada promoción de la expresión de per . [8]
El modelo TTFL de los mamíferos contiene muchos componentes que son homólogos de los que se encuentran en Drosophila . La forma en que funciona el sistema de los mamíferos es que BMAL1 forma un heterodímero con CLOCK para iniciar la transcripción de mPer y criptocromo ( cry ). Hay tres parálogos, o genes históricamente similares que ahora aparecen como una duplicación, del gen period en los mamíferos enumerados como mPer1 , mPer2 y mPer3 . También hay dos parálogos de criptocromo en los mamíferos. Las proteínas PER y CRY forman un heterodímero, y la fosforilación de PER por CK1δ y CK1ε regula la localización del dímero en el núcleo. En el núcleo, PER-CRY regula negativamente la transcripción de sus genes cognados al unirse a BMAL1-CLOCK y provocar su liberación del promotor E-box. [8]
Aunque los parálogos de mPer trabajan juntos como un ortólogo funcional de dPer , cada uno tiene una función diferenciada. mPer1 y mPer2 son necesarios para la función del reloj en el cerebro, mientras que mPer3 solo juega un papel discernible en los ritmos circadianos de los tejidos periféricos. La eliminación de mPer1 o mPer2 provoca un cambio en el período, con la eliminación de mPer1 funcionando libremente con un período más corto y la eliminación de mPer2 funcionando libremente con un período más largo en comparación con la tau original antes de finalmente volverse arrítmica. De manera similar, la eliminación de mCry1 da como resultado un período acortado y la eliminación de mCry2 da como resultado un período alargado, con una doble eliminación de mCry1 /m Cry2 dando como resultado arritmicidad. [8]
También hay bucles secundarios en mamíferos, aunque son más complejos que los observados en Drosophila . Al igual que CWO en Drosophila , Deleted en cáncer de esófago1,2 (Dec1 Dec2) reprime la expresión de mPer al unirse a las cajas E, lo que evita que CLOCK-BMAL1 se una a sus objetivos. Los receptores REV-ERB y el receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico (ROR) desempeñan un papel similar al de PDP1ε y VRI en Drosophila , excepto que regulan al socio de unión de CLOCK, BMAL1, en lugar de regular directamente a CLOCK. La proteína de unión al sitio D (DBP) y la proteína de unión a E4 (E4BP4) se unen a la secuencia promotora de la caja D para regular la expresión de mPer . [8]
La forma en que estos genes se relacionan con Drosophila melanogaster se ve en la función de cada uno de los genes y cómo han cambiado evolutivamente. BMAL1 es un ortólogo de CYCLE . Esto significa que BMAL1 y CYCLE parecen tener una historia común, pero se encuentran en diferentes especies. Otro ejemplo de los paralelismos entre Drosophila melanogaster y los mamíferos también se ve en cry y mPer , ya que son ortólogos funcionales de per y tim . [8]
El gen de frecuencia ( frq ) en Neurospora fue identificado como el segundo gen de reloj conocido en 1979 por JF Feldman y sus colegas. Frq fue clonado por primera vez en 1989 por CR McClung y sus colegas. Este gen fue de particular interés porque su expresión es muy compleja en comparación con otros genes microbianos conocidos. Dos proteínas reguladoras positivas, White Collar-1 (WC-1) y White Collar-2 (WC-2) se unen al promotor frq, que se llama Clock Box, durante la noche subjetiva tardía para activar la transcripción. La luz también es importante para inducir la expresión de FRQ; WC-1 es un fotopigmento, y la luz permite que WC-1 y WC-2 se unan a otro promotor llamado elemento de respuesta a la luz proximal (PLRE). La proteína FRQ regula negativamente la actividad de WC-1 y WC-2. Varias quinasas (CK1, CK2 y PRD-4/quinasa de punto de control 2) y fosfatasas (PP1 y PP2A) regulan la capacidad de FRQ para translocarse al núcleo y la estabilidad de FRQ, WC-1 y WC-2. [9]
El primer modelo TTFL se propuso para Arabidopsis thaliana en 2001 e incluía dos factores de transcripción MYB, LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY), CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) y TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1). CCA1 y LHY se expresan por la mañana e interactúan juntos para reprimir la expresión de TOC1. La expresión de CCA1 y LHY disminuye en la oscuridad, lo que permite que TOC1 se exprese y regule negativamente la expresión de CCA1 y LHY. CCA1 y LHY también pueden unirse a su propio promotor para reprimir su propia transcripción. [10]
Existe un segundo bucle que involucra a PRR9, PRR7 y PRR5, que son todos homólogos de TOC1 y reprimen la expresión de CCA1 y LHY. Estos genes PRR son reprimidos directamente por LHY y TOC1. Estos genes también son regulados por el “complejo vespertino” (EC), que está formado por LUX ARRHYTHMO (LUX), EARLY FLOWERING 3 (ELF3) y EARLY FLOWERING 4 (ELF4). LUX es un factor de transcripción con una función similar a MYB, mientras que ELF3 y ELF4 son proteínas nucleares cuyas funciones se desconocen. El “complejo vespertino” promueve indirectamente la expresión de LHY y CCA1, que reprimen la transcripción de sus propios componentes. Dado que este modelo consta de dos inhibiciones que conducen a una activación, también se lo conoce como represor. [10]
Un bucle descubierto recientemente incluye la familia de genes diana ( reveille ), que se expresan por la mañana e inducen la transcripción de genes vespertinos como PRR5, TOC1, LUX y ELF4. Una vez que se traducen las proteínas resultantes, PRR9, PRR7 y PRR5 reprimen RVE8. RVE8 también interactúa con los componentes matutinos NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED (LNK1, 2, 3 y 4), y los LNK antagonizan o coactivan RVE8. [10]
Aunque GIGANTEA (GI) no se considera una parte fundamental del modelo TTFL de Arabdopsis , es reprimida por CCA1, LHY y TOC1. Además, GI activa la expresión de CCA1 y LHY. [10]
Los estudios del reloj de las cianobacterias llevaron al descubrimiento de tres genes esenciales del reloj: KaiA , KaiB y KaiC . Inicialmente, se pensó que estas proteínas seguían el modelo TTFL similar al propuesto para eukarya , ya que había un patrón diario en la abundancia de ARNm y proteínas y el nivel de fosforilación, retroalimentación negativa de las proteínas en sus genes cognados, restablecimiento de la fase del reloj en respuesta a la sobreexpresión de KaiC y actividad Kai modificada a través de interacciones entre sí. [11] Cada uno de estos resultados fue consistente con los conocimientos sobre el TTFL en ese momento. Sin embargo, estudios posteriores han concluido desde entonces que las modificaciones postraduccionales como la fosforilación son más importantes para el control del reloj. Cuando los promotores de las proteínas Kai se reemplazaron con promotores no específicos, no hubo interrupción del ciclo de retroalimentación central, como se esperaría si la inhibición ocurriera a través de la retroalimentación de las proteínas sobre sus promotores específicos. Como consecuencia, se ha determinado en gran medida que el modelo TTFL es inexacto para las cianobacterias; La regulación transcripcional no es el proceso central que impulsa los ritmos de las cianobacterias. Aunque existen regulaciones transcripcionales y traduccionales, se las consideró efectos del reloj en lugar de ser necesarias para su funcionamiento. [12]
También se han descubierto bucles de retroalimentación postraduccional (PTFL, por sus siglas en inglés) involucrados en la regulación de los genes del reloj, que a menudo funcionan en conjunto con el modelo TTFL. Tanto en mamíferos como en plantas, las modificaciones postraduccionales, como la fosforilación y la acetilación, regulan la abundancia y/o actividad de los genes y proteínas del reloj. Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles de fosforilación de los componentes TTFL varían rítmicamente. Estas modificaciones postraduccionales pueden servir como señales de degradación, reguladores de unión y señales para el reclutamiento de factores adicionales. [13]
En particular, las cianobacterias muestran cambios rítmicos de 24 horas en la fosforilación en un ciclo de retroalimentación que es independiente de la transcripción y la traducción: se observan ritmos circadianos en la fosforilación cuando las proteínas Kai del ciclo de retroalimentación se colocan en un tubo de ensayo con ATP, independientemente de cualquier otra maquinaria celular. Este sistema postraduccional de tres proteínas es ampliamente aceptado como el oscilador central, tanto necesario como suficiente para impulsar los ritmos diarios. [14] Además del sistema Kai en las cianobacterias, se ha demostrado que la oxidación de las proteínas peroxirredoxinas ocurre independientemente de la transcripción y la traducción tanto en los glóbulos rojos de mamíferos como en las células de las algas Ostreococcus tauri ; se ha visto que este sistema se conserva en muchos organismos. [15] No está claro si el sistema de peroxirredoxina interactúa con los relojes basados en TTFL o es en sí mismo parte de un nuevo reloj basado en PTFL. Sin embargo, ambos hallazgos implican que en algunos organismos o tipos de células, los PTFL son suficientes para impulsar los ritmos circadianos.