El análisis de partículas individuales es un grupo de técnicas de procesamiento de imágenes computarizadas relacionadas que se utilizan para analizar imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM). [1] Estos métodos se desarrollaron para mejorar y ampliar la información obtenible de las imágenes TEM de muestras de partículas, típicamente proteínas u otras entidades biológicas grandes como virus . Las imágenes individuales de partículas teñidas o no teñidas son muy ruidosas y, por lo tanto, difíciles de interpretar. La combinación de varias imágenes digitalizadas de partículas similares proporciona una imagen con características más fuertes y más fáciles de interpretar. Una extensión de esta técnica utiliza métodos de partículas individuales para construir una reconstrucción tridimensional de la partícula. Usando criomicroscopía electrónica se ha hecho posible generar reconstrucciones con resolución subnanómetro y resolución casi atómica [2] [3] primero en el caso de virus altamente simétricos, y ahora también en proteínas más pequeñas y asimétricas. [4] El análisis de partículas individuales también se puede realizar mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).
El análisis de partículas individuales se puede realizar tanto en muestras con tinción negativa como en muestras criomicroscópicas electrónicas de transmisión (CryoTEM) con hielo vítreo incluido . Los métodos de análisis de partículas individuales dependen, en general, de que la muestra sea homogénea, aunque se están desarrollando técnicas para abordar la heterogeneidad conformacional [5] .
Las imágenes (micrografías) se toman con un microscopio electrónico utilizando detectores de dispositivos acoplados por carga (CCD) acoplados a una capa fosforescente (en el pasado, se recogían en película y se digitalizaban utilizando escáneres de alta calidad). El procesamiento de imágenes se lleva a cabo utilizando programas de software especializados, a menudo ejecutados en clústeres de computadoras con múltiples procesadores . Dependiendo de la muestra o de los resultados deseados, se pueden realizar varios pasos de procesamiento bidimensional o tridimensional.
Además, el análisis de partículas individuales también se puede realizar en un modo de partículas individuales utilizando una unidad ICP-MS.
Las muestras biológicas, y especialmente las muestras embebidas en hielo vítreo delgado , son altamente sensibles a la radiación, por lo que solo se pueden usar dosis bajas de electrones para obtener imágenes de la muestra. Esta dosis baja, así como las variaciones en la mancha de metal utilizada (si se usa) [6] significa que las imágenes tienen un alto ruido en relación con la señal dada por la partícula que se observa. Al alinear varias imágenes similares entre sí para que estén registradas y luego promediarlas, se puede obtener una imagen con una mayor relación señal-ruido . Como el ruido se distribuye en su mayoría de forma aleatoria y las características de la imagen subyacente son constantes, al promediar la intensidad de cada píxel en varias imágenes, solo se refuerzan las características constantes. Normalmente, la alineación óptima (una traslación y una rotación en el plano) para mapear una imagen sobre otra se calcula mediante correlación cruzada .
Sin embargo, una micrografía a menudo contiene partículas en múltiples orientaciones y/o conformaciones diferentes, por lo que para obtener promedios de imágenes más representativos, se requiere un método para agrupar imágenes de partículas similares en múltiples conjuntos. Esto normalmente se lleva a cabo utilizando uno de varios algoritmos de análisis de datos y clasificación de imágenes, como el análisis estadístico multivariante y la clasificación ascendente jerárquica, o el agrupamiento de k -medias . [ cita requerida ]
A menudo se utilizan conjuntos de datos de decenas de miles de imágenes de partículas y, para alcanzar una solución óptima, se utiliza un procedimiento iterativo de alineación y clasificación, mediante el cual los promedios de imágenes fuertes producidos por la clasificación se utilizan como imágenes de referencia para una alineación posterior de todo el conjunto de datos.
El filtrado de imágenes ( filtrado de paso de banda ) se utiliza a menudo para reducir la influencia de la información de frecuencia espacial alta y/o baja en las imágenes, que puede afectar los resultados de los procedimientos de alineación y clasificación. Esto es particularmente útil en imágenes de manchas negativas . Los algoritmos hacen uso de transformadas rápidas de Fourier ( FFT ), a menudo empleando máscaras de bordes suaves con forma gaussiana en el espacio recíproco para suprimir ciertos rangos de frecuencia. Los filtros de paso alto eliminan las frecuencias espaciales bajas (como los efectos de rampa o gradiente), dejando intactas las frecuencias más altas. Los filtros de paso bajo eliminan las características de alta frecuencia espacial y tienen un efecto de desenfoque en los detalles finos.
Debido a la naturaleza de la formación de imágenes en el microscopio electrónico, las imágenes TEM de campo claro se obtienen utilizando un subenfoque significativo . Esto, junto con las características inherentes al sistema de lentes del microscopio, crea un desenfoque de las imágenes recopiladas visible como una función de dispersión de puntos . Los efectos combinados de las condiciones de obtención de imágenes se conocen como la función de transferencia de contraste (CTF), y se pueden aproximar matemáticamente como una función en el espacio recíproco. Las técnicas especializadas de procesamiento de imágenes, como la inversión de fase y la corrección de amplitud / filtrado de Wiener, pueden (al menos parcialmente) [7] corregir la CTF y permitir reconstrucciones de alta resolución.
Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión son proyecciones del objeto que muestran la distribución de la densidad a través del objeto, de manera similar a los rayos X médicos. Al hacer uso del teorema de proyección-corte , se puede generar una reconstrucción tridimensional del objeto combinando muchas imágenes (proyecciones 2D) del objeto tomadas desde un rango de ángulos de visión. Las proteínas en el hielo vítreo adoptan idealmente una distribución aleatoria de orientaciones (o ángulos de visión), lo que permite una reconstrucción bastante isotrópica si se utiliza una gran cantidad de imágenes de partículas. Esto contrasta con la tomografía electrónica , donde los ángulos de visión están limitados debido a la geometría de la muestra/configuración de imágenes, lo que da como resultado una reconstrucción anisotrópica . La retroproyección filtrada es un método comúnmente utilizado para generar reconstrucciones 3D en el análisis de partículas individuales, aunque existen muchos algoritmos alternativos. [3]
Antes de poder realizar una reconstrucción, es necesario estimar la orientación del objeto en cada imagen. Se han desarrollado varios métodos para calcular los ángulos de Euler relativos de cada imagen. Algunos se basan en líneas comunes (proyecciones 1D comunes y sinogramas ), otros utilizan algoritmos iterativos de coincidencia de proyecciones. Este último funciona partiendo de un modelo inicial 3D simple y de baja resolución y compara las imágenes experimentales con las proyecciones del modelo y crea un nuevo 3D para avanzar hacia una solución.
También existen métodos para realizar reconstrucciones tridimensionales de muestras helicoidales (como el virus del mosaico del tabaco ), aprovechando la simetría helicoidal inherente . Para estas muestras se pueden utilizar tanto métodos de espacio real (que tratan secciones de la hélice como partículas individuales) como métodos de espacio recíproco (que utilizan patrones de difracción).
La platina de la muestra del microscopio se puede inclinar (normalmente a lo largo de un solo eje), lo que permite la técnica de partícula única conocida como inclinación cónica aleatoria. [8] Se toma una imagen de un área de la muestra tanto en inclinaciones de ángulo cero como de ángulo alto (~60-70 grados), o en el caso del método relacionado de reconstrucción de inclinación ortogonal, [9] +45 y −45 grados. Se seleccionan pares de partículas correspondientes al mismo objeto en dos inclinaciones diferentes (pares de inclinación) y, siguiendo los parámetros utilizados en los pasos posteriores de alineación y clasificación, se puede generar una reconstrucción tridimensional con relativa facilidad. Esto se debe a que el ángulo de visión (definido como tres ángulos de Euler ) de cada partícula se conoce a partir de la geometría de inclinación.
Las reconstrucciones 3D a partir de inclinaciones cónicas aleatorias sufren la falta de información resultante de un rango restringido de orientaciones. Esto, conocido como el cono faltante [10] (debido a la forma en el espacio recíproco), causa distorsiones en los mapas 3D. Sin embargo, el problema del cono faltante a menudo se puede superar combinando varias reconstrucciones de inclinación. Los métodos de inclinación son más adecuados para muestras teñidas negativamente y se pueden utilizar para partículas que se adsorben a la película de soporte de carbono en orientaciones preferidas. El fenómeno conocido como movimiento inducido por carga o haz [11] hace que la recolección de imágenes de muestras con alta inclinación en hielo vítreo sea un desafío.
Existen varios programas de software que permiten visualizar los mapas 3D. Estos suelen permitir al usuario acoplar manualmente las coordenadas de las proteínas (estructuras obtenidas por cristalografía de rayos X o RMN) de las subunidades a la densidad electrónica. Varios programas también pueden ajustar las subunidades computacionalmente. [12] [13]
Para estructuras de mayor resolución, es posible construir la macromolécula directamente, sin conocimientos estructurales previos obtenidos con otros métodos. También se han desarrollado algoritmos informáticos para esta tarea. [14]
Como los modelos crio-EM de alta resolución son relativamente nuevos, las herramientas de control de calidad no son tan abundantes como lo son para los modelos de rayos X. Sin embargo, han comenzado a aparecer versiones crio-EM ("espacio real") del mapa de densidad de diferencia , [15] validación cruzada utilizando un mapa "libre" (comparable al uso de un factor R libre ), [16] [17] y varias herramientas de validación de estructura .
La espectroscopia de masas de plasma acoplado inducido por partículas individuales (SP-ICP-MS) se utiliza en varias áreas donde existe la posibilidad de detectar y cuantificar partículas suspendidas en muestras de fluidos ambientales, evaluar su migración, evaluar el tamaño de las partículas y su distribución, y también determinar su estabilidad en un entorno determinado. La SP-ICP-MS fue diseñada para suspensiones de partículas en 2000 por Claude Degueldre. Probó por primera vez esta nueva metodología en el Instituto Forel de la Universidad de Ginebra y presentó este nuevo enfoque analítico en el simposio 'Colloid 2oo2' durante la reunión de primavera de 2002 del EMRS, y en las actas de 2003. [18] Este estudio presenta la teoría de la SP ICP-MS y los resultados de pruebas realizadas en partículas de arcilla (montmorillonita), así como otras suspensiones de coloides. Este método fue probado luego en nanopartículas de dióxido de torio por Degueldre y Favarger (2004), [19] dióxido de zirconio por Degueldre et al (2004) [20] y nanopartículas de oro, que se utilizan como sustrato en nanofarmacia, y publicado por Degueldre et al (2006). [21] Posteriormente, el estudio de nano y micropartículas de dióxido de uranio dio lugar a una publicación detallada, Ref. Degueldre et al (2006). [22] Desde 2010, el interés por SP ICP-MS ha explotado.
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