Tuvo cinco hermanos entre los que destacó Thomas Bartholin (nueve años mayor), que alcanzó tanta fama como él por sus hallazgos científicos relacionados con el sistema linfático.
Posteriormente, entró en la Universidad de Copenhague en 1642, donde se licenció en 1644 y obtuvo un máster en artes en 1647.
Pudo observar como la luz se refractaba a través del espato dando lugar a dos rayos que él denominó solita e insolita.
Aunque publicó una descripción muy precisa del fenómeno no fue capaz de comprender su naturaleza física.
Fue más tarde, en 1801, cuando Thomas Young propuso la teoría ondulatoria de la luz y se pudo dar una explicación al fenómeno de la refracción doble, que realmente se producía porque el cristal divide la luz dos planos de haces polarizados.