Tuvo cinco hermanos entre los que destacó Rasmus Bartholin (nueve años menor), que alcanzó tanta fama como él por sus hallazgos científicos relacionados con la refracción doble de la luz.

Aunque dicho descubrimiento fue realizado a la vez por Olaus Rudbeck, Thomas Bartholin lo publicó primero.

Su padre publicó la primera colección anatómica en 1611, que fue ilustrada y revisada más adelante por Thomas, lo que convirtió a este trabajo en la referencia por excelencia de la anatomía.

En 1680 Bartholin enferma, por lo cual vende la granja y regresa a Copenhague, dónde fallece poco más tarde.

Fue sepultado en Vor Frue Kirke (la Iglesia de Nuestra Señora).