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Dedo de zinc

Representación en caricatura del motivo del dedo de zinc Cys2His2, que consta de una hélice α y una lámina β antiparalela . El ion zinc (verde) está coordinado por dos residuos de histidina y dos residuos de cisteína .
Representación en caricatura de la proteína Zif268 (azul) que contiene tres dedos de zinc en complejo con ADN (naranja). Los residuos de aminoácidos coordinantes y los iones de zinc (verde) están resaltados.

Un dedo de zinc es un pequeño motivo estructural proteico que se caracteriza por la coordinación de uno o más iones de zinc (Zn 2+ ) que estabiliza el pliegue. Fue acuñado originalmente para describir la apariencia en forma de dedo de una estructura hipotética del factor de transcripción IIIA de la rana con garras africana ( Xenopus laevis ) . Sin embargo, se ha descubierto que abarca una amplia variedad de estructuras proteicas diferentes en las células eucariotas . [1] Se demostró originalmente que Xenopus laevis TFIIIA contenía zinc y requería el metal para funcionar en 1983, el primer requisito de zinc informado para una proteína reguladora de genes [2] [3] seguido poco después por el factor Krüppel en Drosophila . [4] A menudo aparece como un dominio de unión a metales en proteínas multidominio. [3]

Las proteínas que contienen dedos de zinc ( proteínas con dedos de zinc ) se clasifican en varias familias estructurales diferentes. A diferencia de muchas otras estructuras supersecundarias claramente definidas, como las llaves griegas o las horquillas β , existen varios tipos de dedos de zinc, cada uno con una arquitectura tridimensional única. La clase particular de una proteína con dedos de zinc está determinada por esta estructura tridimensional, pero también puede reconocerse en función de la estructura primaria de la proteína o de la identidad de los ligandos que coordinan el ion zinc. Sin embargo, a pesar de la gran variedad de estas proteínas, la gran mayoría normalmente funciona como módulos de interacción que se unen al ADN , ARN , proteínas u otras moléculas pequeñas y útiles, y las variaciones en la estructura sirven principalmente para alterar la especificidad de unión de una proteína en particular. .

Desde su descubrimiento original y el esclarecimiento de su estructura, estos módulos de interacción han demostrado ser ubicuos en el mundo biológico y pueden encontrarse en el 3% de los genes del genoma humano. [5] Además, los dedos de zinc se han vuelto extremadamente útiles en diversas capacidades terapéuticas y de investigación. La ingeniería de dedos de zinc para que tengan afinidad por una secuencia específica es un área de investigación activa, y las nucleasas de dedos de zinc y los factores de transcripción de dedos de zinc son dos de las aplicaciones más importantes que se han realizado hasta la fecha.

Historia

Los dedos de zinc se identificaron por primera vez en un estudio de transcripción en la rana africana con garras , Xenopus laevis, en el laboratorio de Aaron Klug . Un estudio de la transcripción de una secuencia de ARN particular reveló que la fuerza de unión de un pequeño factor de transcripción (factor de transcripción IIIA; TFIIIA) se debía a la presencia de estructuras similares a dedos que coordinan el zinc. [6] La secuenciación de aminoácidos de TFIIIA reveló nueve secuencias en tándem de 30 aminoácidos, incluidos dos pares invariantes de residuos de cisteína e histidina. La estructura fina de absorción extendida de rayos X confirmó la identidad de los ligandos de zinc: dos cisteínas y dos histidinas. [5] Se pensaba que el bucle de unión al ADN formado por la coordinación de estos ligandos por el zinc se parecía a los dedos, de ahí el nombre. [1] A esto le siguió poco después el descubrimiento del factor Krüppel en Drosophila por el equipo de Schuh en 1986. [4] Trabajos más recientes en la caracterización de proteínas en varios organismos han revelado la importancia de los iones de zinc en la estabilización de polipéptidos. [7] [8]

Las estructuras cristalinas de los complejos de dedos de zinc y ADN resueltas en 1991 y 1993 revelaron el patrón canónico de interacciones de los dedos de zinc con el ADN. [9] [10] Se ha descubierto que la unión del dedo de zinc es distinta de muchas otras proteínas de unión al ADN que se unen al ADN a través de la simetría doble de la doble hélice; en cambio, los dedos de zinc se unen linealmente en tándem para unir secuencias de ácido nucleico. de longitudes variables. [5] Los dedos de zinc a menudo se unen a una secuencia de ADN conocida como caja GC . [11] La naturaleza modular del motivo del dedo de zinc permite unir una gran cantidad de combinaciones de secuencias de ADN y ARN con un alto grado de afinidad y especificidad y, por lo tanto, es ideal para diseñar proteínas que puedan dirigirse y unirse a proteínas específicas. Secuencias de ADN. En 1994, se demostró que una proteína de tres dedos construida artificialmente puede bloquear la expresión de un oncogén en una línea celular de ratón. Desde entonces se han construido dedos de zinc fusionados a varios otros dominios efectores, algunos con importancia terapéutica. [5]

Dominio

Los dominios de dedos de zinc (Znf) son motivos proteicos relativamente pequeños que contienen múltiples protuberancias en forma de dedos que establecen contactos en tándem con su molécula objetivo. Algunos de estos dominios se unen al zinc, pero muchos no, sino que se unen a otros metales como el hierro, o a ningún metal. Por ejemplo, algunos miembros de la familia forman puentes de sal para estabilizar los pliegues en forma de dedos . Se identificaron por primera vez como un motivo de unión al ADN en el factor de transcripción TFIIIA de Xenopus laevis (rana con garras africana); sin embargo, ahora se reconoce que se unen a sustratos de ADN, ARN, proteínas y/o lípidos . [12] [13] [14] [15] [16] Sus propiedades de unión dependen de la secuencia de aminoácidos de los dominios de los dedos y del conector entre los dedos, así como de las estructuras de orden superior y del número de dedos. Los dominios Znf se encuentran a menudo en grupos, donde los dedos pueden tener diferentes especificidades de unión. Los motivos Znf ocurren en varias superfamilias de proteínas no relacionadas , que varían tanto en secuencia como en estructura. Muestran una considerable versatilidad en los modos de unión, incluso entre miembros de la misma clase (p. ej., algunos se unen al ADN, otros a proteínas), lo que sugiere que los motivos Znf son estructuras estables que han desarrollado funciones especializadas. Por ejemplo, las proteínas que contienen Znf funcionan en la transcripción de genes , la traducción, el tráfico de ARNm, la organización del citoesqueleto , el desarrollo epitelial , la adhesión celular , el plegamiento de proteínas, la remodelación de la cromatina y la detección de zinc, por nombrar solo algunos. [17] Los motivos de unión a zinc son estructuras estables y rara vez sufren cambios conformacionales al unirse a su objetivo.

Clases

Inicialmente, el término dedo de zinc se utilizó únicamente para describir el motivo de unión al ADN encontrado en Xenopus laevis ; sin embargo, ahora se utiliza para referirse a cualquier número de estructuras relacionadas por su coordinación de un ion zinc. En general, los dedos de zinc coordinan los iones de zinc con una combinación de residuos de cisteína e histidina . Originalmente, el número y orden de estos residuos se utilizaba para clasificar diferentes tipos de dedos de zinc (por ejemplo, Cys 2 His 2 , Cys 4 y Cys 6 ). Más recientemente, se ha utilizado un método más sistemático para clasificar las proteínas con dedos de zinc. Este método clasifica las proteínas con dedos de zinc en "grupos plegados" según la forma general de la columna vertebral de la proteína en el dominio plegado. Los "grupos de pliegues" más comunes de dedos de zinc son el tipo Cys 2 His 2 (el "dedo de zinc clásico"), la clave de sol y la cinta de zinc. [18]

La siguiente tabla [18] muestra las diferentes estructuras y sus características clave:

Cys 2 Su 2

El grupo Cys 2 His 2 (C2H2) es, con diferencia, la clase mejor caracterizada de dedos de zinc y es común en los factores de transcripción de los mamíferos. Dichos dominios adoptan un pliegue ββα simple y tienen el motivo de secuencia de aminoácidos : [19]

X 2 -Cys-X 2,4 -Cys-X 12 -Su-X 3,4,5 -Su

Esta clase de dedos de zinc puede tener una variedad de funciones, como la unión de ARN y la mediación de interacciones entre proteínas, pero es más conocida por su papel en proteínas de unión a ADN de secuencia específica, como Zif268 (Egr1). En dichas proteínas, los dominios de dedos de zinc individuales suelen aparecer como repeticiones en tándem con dos, tres o más dedos que comprenden el dominio de unión al ADN de la proteína. Estas matrices en tándem pueden unirse al surco principal del ADN y normalmente están espaciadas a intervalos de 3 pb. La hélice α de cada dominio (a menudo denominada "hélice de reconocimiento") puede establecer contactos específicos de secuencia con las bases del ADN; Los residuos de una única hélice de reconocimiento pueden contactar con cuatro o más bases para producir un patrón superpuesto de contactos con dedos de zinc adyacentes.

nudillo mordaza

Este grupo de pliegues está definido por dos hebras β cortas conectadas por una vuelta (nudillo de zinc) seguida de una hélice o bucle corto y se asemeja al motivo clásico Cys 2 His 2 con una gran porción de la hélice y la horquilla β truncadas.

La proteína retroviral de la nucleocápside (NC) del VIH y otros retrovirus relacionados son ejemplos de proteínas que poseen estos motivos. El dedo de zinc en forma de nudillo de mordaza en la proteína NC del VIH es el objetivo de una clase de medicamentos conocidos como inhibidores de dedos de zinc .

clave de sol

El motivo de clave de sol consiste en una horquilla β en el extremo N y una hélice α en el extremo C, cada una de las cuales contribuye con dos ligandos para la unión del zinc, aunque se pueden formar un bucle y una segunda horquilla β de longitud y conformación variables. estar presente entre la horquilla β N-terminal y la hélice α C-terminal. Estos dedos están presentes en un grupo diverso de proteínas que frecuentemente no comparten secuencia o similitud funcional entre sí. Las proteínas mejor caracterizadas que contienen dedos de zinc en clave de sol son los receptores hormonales nucleares .

Cinta de zinc

El pliegue de la cinta de zinc se caracteriza por dos horquillas beta que forman dos subsitios de unión de zinc estructuralmente similares.

Zn2 / Cys6​

Los miembros canónicos de esta clase contienen un grupo binuclear de zinc en el que dos iones de zinc están unidos por seis residuos de cisteína . Estos dedos de zinc se pueden encontrar en varios factores de transcripción, incluida la proteína Gal4 de levadura.

Misceláneas

La proteína antiviral dedo de zinc (ZAP ) se une al sitio CpG. Se utiliza en mamíferos como defensa antiviral. [20] [21]

Aplicaciones

Se pueden usar varias técnicas de ingeniería de proteínas para alterar la especificidad de unión al ADN de los dedos de zinc [19] y se pueden usar repeticiones en tándem de dichos dedos de zinc diseñados para apuntar a las secuencias de ADN genómico deseadas. [22] La fusión de un segundo dominio proteico, como un activador o represor transcripcional, con una serie de dedos de zinc diseñados que se unen cerca del promotor de un gen determinado, se puede utilizar para alterar la transcripción de ese gen. [22] Las fusiones entre matrices de dedos de zinc diseñadas y dominios proteicos que escinden o modifican el ADN también se pueden utilizar para dirigir esas actividades a los loci genómicos deseados. [22] Las aplicaciones más comunes para las matrices de dedos de zinc diseñadas incluyen factores de transcripción de dedos de zinc y nucleasas de dedos de zinc , pero también se han descrito otras aplicaciones. Las matrices de dedos de zinc diseñadas típicas tienen entre 3 y 6 motivos de dedos de zinc individuales y se unen a sitios objetivo que varían de 9 a 18 pares de bases de longitud. Las matrices con seis motivos de dedos de zinc son particularmente atractivas porque se unen a un sitio objetivo que es lo suficientemente largo como para tener buenas posibilidades de ser únicos en el genoma de un mamífero. [23]

Nucleasas con dedos de zinc

Las matrices de dedos de zinc diseñadas a menudo se fusionan a un dominio de escisión de ADN (generalmente el dominio de escisión de FokI ) para generar nucleasas de dedos de zinc . Estas fusiones de dedos de zinc y FokI se han convertido en reactivos útiles para manipular genomas de muchos organismos superiores, incluidos Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , tabaco , maíz , [24] pez cebra , [25] varios tipos de células de mamíferos, [26] y ratas . [27] Dirigir una rotura de doble hebra a un locus genómico deseado se puede utilizar para introducir mutaciones de cambio de marco en la secuencia codificante de un gen debido a la naturaleza propensa a errores de la vía de reparación del ADN no homólogo. Si también se utiliza una "secuencia donante" de ADN homólogo, entonces el locus genómico se puede convertir en una secuencia definida a través de la vía de reparación dirigida por homología. Un ensayo clínico en curso está evaluando las nucleasas con dedos de zinc que alteran el gen CCR5 en las células T humanas CD4 + como posible tratamiento para el VIH/SIDA . [28]

Métodos de ingeniería de matrices de dedos de zinc.

La mayoría de las matrices de dedos de zinc diseñadas se basan en el dominio de dedos de zinc del factor de transcripción murino Zif268, aunque algunos grupos han utilizado matrices de dedos de zinc basadas en el factor de transcripción humano SP1. Zif268 tiene tres motivos de dedos de zinc individuales que se unen colectivamente a una secuencia de 9 pb con alta afinidad. [29] La estructura de esta proteína unida al ADN se resolvió en 1991 [9] y estimuló una gran cantidad de investigaciones sobre matrices de dedos de zinc diseñadas. En 1994 y 1995, varios grupos utilizaron la presentación en fagos para alterar la especificidad de un único dedo de zinc de Zif268. [30] [31] [32] [33] Actualmente se utilizan dos métodos principales para generar matrices de dedos de zinc diseñadas, ensamblajes modulares y un sistema de selección bacteriana, y existe cierto debate sobre qué método es el más adecuado para la mayoría de las aplicaciones. [34] [35]

El método más sencillo para generar nuevas matrices de dedos de zinc es combinar "módulos" de dedos de zinc más pequeños de especificidad conocida. La estructura de la proteína con dedos de zinc Zif268 unida al ADN descrita por Pavletich y Pabo en su publicación de 1991 ha sido clave para gran parte de este trabajo y describe el concepto de obtener dedos para cada uno de los 64 posibles tripletes de pares de bases y luego mezclarlos y combinarlos. dedos para diseñar proteínas con cualquier especificidad de secuencia deseada. [9] El proceso de ensamblaje modular más común implica combinar dedos de zinc separados, cada uno de los cuales puede reconocer una secuencia de ADN de 3 pares de bases para generar matrices de 3, 4, 5 o 6 dedos que reconocen sitios objetivo que van desde 9 pares de bases hasta 18 pares de bases de longitud. Otro método utiliza módulos de 2 dedos para generar matrices de dedos de zinc con hasta seis dedos de zinc individuales. [24] El Laboratorio Barbas del Instituto de Investigación Scripps utilizó la presentación en fagos para desarrollar y caracterizar dominios de dedos de zinc que reconocen la mayoría de las secuencias tripletes de ADN [36] [37] [38] mientras que otro grupo aisló y caracterizó dedos individuales del genoma humano. [39] Un posible inconveniente del ensamblaje modular en general es que las especificidades de los dedos de zinc individuales pueden superponerse y pueden depender del contexto de los dedos de zinc y el ADN circundantes. Un estudio reciente demostró que una alta proporción de matrices de dedos de zinc de tres dedos generadas mediante ensamblaje modular no logran unirse a su objetivo previsto con suficiente afinidad en un ensayo bacteriano de dos híbridos y no funcionan como nucleasas de dedos de zinc , pero la tasa de éxito fue algo mayor cuando se apuntaban a sitios del tipo GNNGNNGNN. [40]

Un estudio posterior utilizó un ensamblaje modular para generar nucleasas con dedos de zinc con matrices de 3 y 4 dedos y observó una tasa de éxito mucho mayor con matrices de 4 dedos. [41] También se ha informado sobre una variante de ensamblaje modular que tiene en cuenta el contexto de los dedos vecinos y este método tiende a producir proteínas con un rendimiento mejorado en relación con el ensamblaje modular estándar. [42]

Se han utilizado numerosos métodos de selección para generar matrices de dedos de zinc capaces de apuntar a secuencias deseadas. Los esfuerzos de selección iniciales utilizaron la presentación de fagos para seleccionar proteínas que se unían a un objetivo de ADN determinado de un gran conjunto de matrices de dedos de zinc parcialmente aleatorias. Esta técnica es difícil de usar en más de un dedo de zinc a la vez, por lo que se desarrolló un proceso de varios pasos que generó una matriz de tres dedos completamente optimizada al agregar y optimizar un solo dedo de zinc a la vez. [43] Esfuerzos más recientes han utilizado sistemas de un híbrido de levadura, sistemas bacterianos de un híbrido y dos híbridos y células de mamíferos. Un nuevo método prometedor para seleccionar nuevas matrices de dedos de zinc de tres dedos utiliza un sistema bacteriano de dos híbridos y sus creadores lo han denominado "ABIERTO". [44] Este sistema combina grupos preseleccionados de dedos de zinc individuales, cada uno de los cuales fue seleccionado para unirse a un triplete determinado y luego utiliza una segunda ronda de selección para obtener matrices de 3 dedos capaces de unirse a una secuencia deseada de 9 pb. Este sistema fue desarrollado por Zinc Finger Consortium como una alternativa a las fuentes comerciales de conjuntos de dedos de zinc diseñados. Es algo difícil comparar directamente las propiedades de unión de las proteínas generadas con este método con las proteínas generadas mediante ensamblaje modular, ya que nunca se han informado los perfiles de especificidad de las proteínas generadas por el método OPEN.

Ejemplos

Esta entrada representa el dominio de dedos de zinc tipo CysCysHisCys (C2HC) que se encuentra en eucariotas . Las proteínas que contienen estos dominios incluyen:

Ver también

Referencias

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