Un contador Coulter [1] [2] es un aparato para contar y medir partículas suspendidas en electrolitos . El contador Coulter es el término comercial para la técnica conocida como detección de pulsos resistivos o detección de zonas eléctricas. El aparato se basa en el principio Coulter, que lleva el nombre de su inventor, Wallace H. Coulter .
Un contador Coulter típico tiene uno o más microcanales que separan dos cámaras que contienen soluciones electrolíticas . A medida que el fluido que contiene partículas o células pasa a través de los microcanales, cada partícula provoca un breve cambio en la resistencia eléctrica del líquido. El contador detecta estos cambios en la resistencia eléctrica.
El principio de Coulter establece que las partículas que pasan a través de un orificio, simultáneamente con una corriente eléctrica , producen un cambio en la impedancia proporcional al volumen de la partícula que atraviesa el orificio. Este impulso en la impedancia se origina a partir del desplazamiento del electrolito causado por la partícula.
El principio de Coulter se basa en el hecho de que las partículas que se mueven en un campo eléctrico provocan perturbaciones mensurables en dicho campo. La magnitud de estas perturbaciones es proporcional al tamaño de las partículas en el campo. Coulter identificó varios requisitos necesarios para la aplicación práctica de este fenómeno:
Si varias partículas pasan simultáneamente por la constricción, sus perfiles de impedancia se superpondrán, lo que dará lugar a un artefacto conocido como coincidencia. El aparato no puede diferenciar entre una partícula grande y varias partículas pequeñas superpuestas, lo que provoca anomalías en los datos resultantes.
Se han diseñado diversos dispositivos experimentales basados en el principio de Coulter. Algunos de estos dispositivos se han comercializado, y las aplicaciones más conocidas se encuentran en la industria médica, en particular en hematología , para contar y medir las distintas células que componen la sangre entera. Todas las implementaciones del principio de Coulter tienen compromisos entre sensibilidad, protección contra el ruido, compatibilidad con disolventes, velocidad de medición, volumen de muestra, rango dinámico y confiabilidad en la fabricación del dispositivo.
Wallace H. Coulter descubrió el principio de Coulter a finales de la década de 1940, aunque no se le concedió una patente hasta el 20 de octubre de 1953. Coulter se vio influenciado por las bombas atómicas lanzadas sobre Hiroshima y Nagasaki , lo que lo motivó a mejorar y agilizar el recuento sanguíneo completo para su uso en pruebas de detección a gran escala, como sería necesario en caso de una guerra nuclear. [3] La financiación parcial del proyecto provino de una subvención concedida por la Oficina de Investigación Naval . [4] [5]
Coulter obtuvo la patente estadounidense n.º 2.656.508, "Medios para contar partículas suspendidas en un fluido" . Este contador Coulter es un instrumento analítico que emplea el principio Coulter para una tarea específica, la más común es el recuento de células. La aplicación comercialmente más exitosa del principio Coulter es en hematología, donde se utiliza para obtener información sobre las células sanguíneas de los pacientes. Los contadores Coulter también se pueden utilizar en el procesamiento y la fabricación de pintura, cerámica, vidrio, metales y alimentos. También se emplean rutinariamente para el control de calidad.
Las células, al ser partículas poco conductoras, alteran la sección transversal efectiva del microcanal conductor. Si estas partículas son menos conductoras que el medio líquido circundante, la resistencia eléctrica a través del canal aumenta, lo que hace que la corriente eléctrica que pasa por el canal disminuya brevemente. Al monitorear dichos pulsos de corriente eléctrica, se puede contar el número de partículas para un volumen dado de fluido. El tamaño del cambio de corriente eléctrica está relacionado con el tamaño de la partícula, lo que permite medir una distribución del tamaño de partícula, que se puede correlacionar con la movilidad, la carga superficial y la concentración de las partículas.
La cantidad y calidad de los datos obtenidos varía en gran medida en función de los circuitos de procesamiento de señales del contador Coulter. Los amplificadores con umbrales de ruido más bajos y un rango dinámico mayor pueden aumentar la sensibilidad del sistema, y los analizadores de altura de pulso digitales con anchos de bin variables proporcionan datos con una resolución mucho mayor en comparación con los analizadores analógicos con bins fijos. La combinación de un contador Coulter con una computadora digital permite la captura y el análisis de muchas características de pulsos eléctricos, mientras que los contadores analógicos suelen almacenar una cantidad limitada de información sobre cada pulso.
A medida que los detectores de corriente eléctrica se volvieron más sensibles y menos costosos, el contador Coulter se convirtió en un instrumento común en los laboratorios de los hospitales para el análisis rápido y preciso de los hemogramas completos . El hemograma se utiliza para determinar la cantidad o proporción de glóbulos blancos y rojos en el cuerpo. Anteriormente, este procedimiento implicaba preparar un frotis de sangre periférica y contar manualmente cada tipo de célula bajo un microscopio , un proceso que normalmente requería media hora.
Un contador Coulter desempeñó un papel importante en el desarrollo del primer clasificador de células y participó en el desarrollo temprano de la citometría de flujo . Algunos citómetros de flujo siguen utilizando el principio de Coulter para proporcionar información sobre el tamaño y el recuento de células.
Si bien un contador Coulter se puede diseñar de distintas maneras, hay dos configuraciones principales que se han vuelto las más relevantes comercialmente: un formato de apertura y un formato de celda de flujo.
El formato de apertura es la configuración más utilizada en los contadores Coulter comerciales y es adecuado para probar muestras para el control de calidad. En esta configuración, se crea una pequeña apertura (agujero) de tamaño específico en un material como un disco de rubí (fabricado del mismo material que los cojinetes de rubí en los relojes). [4] Luego, este disco se incrusta en la pared de un tubo de vidrio, que luego se denomina tubo de apertura. El tubo de apertura se coloca en un líquido conductor de manera que la apertura esté completamente sumergida, y una bomba en la parte superior del tubo aspira líquido a través de la apertura. La corriente eléctrica pasa a través de electrodos a cada lado del tubo de apertura; debido a que el vidrio es un aislante eléctrico, toda esta corriente fluye a través de la apertura. Después de registrar los datos de referencia, la muestra que se analizará se agrega lentamente al líquido conductor y se extrae a través de la apertura. Las variaciones en la conductividad, causadas cuando las partículas de la muestra pasan a través de la apertura, se registran como pulsos eléctricos y se analizan para determinar las características de las partículas y la muestra en su conjunto.
El formato de celda de flujo se implementa con mayor frecuencia en instrumentos de hematología y algunos citómetros de flujo. En este formato, los electrodos se insertan en cada extremo de un canal de flujo y el campo eléctrico se aplica a través del canal. Esta disposición permite el análisis continuo de la muestra y se puede combinar con otros instrumentos (cuando están equipados con un flujo envolvente para mantener las partículas centradas en el medio del canal de flujo). Esto puede permitir que se realicen mediciones adicionales simultáneamente, como sondear la partícula con un láser. Las principales desventajas del formato de celda de flujo son que es mucho más costoso de fabricar y generalmente está fijado a un ancho de canal único, mientras que el formato de apertura ofrece una amplia variedad de tamaños de apertura.
Se han utilizado métodos microfluídicos para aplicar el principio de Coulter a la detección de partículas en un laboratorio en un chip . Estas técnicas permiten fabricar poros (agujeros) mucho más pequeños de los que se pueden lograr fácilmente utilizando el formato de apertura. Estos métodos, conocidos por la frase genérica de detección de pulsos resistivos microfluídicos, han permitido la extensión del principio de Coulter al rango profundo de submicrones , lo que permite, por ejemplo, la detección directa de partículas de virus en fluidos. [6] [7] [8]
Hay una serie de consideraciones comunes a la hora de crear una metodología de prueba con contadores Coulter.
Se pueden generar pulsos eléctricos anómalos si varias partículas entran en la abertura simultáneamente. Esta situación se conoce como coincidencia . Esto ocurre porque no hay forma de garantizar que un único pulso grande sea el resultado de una única partícula grande o de varias partículas pequeñas que entran en la abertura a la vez. Para evitar esta situación, las muestras deben estar bastante diluidas.
La forma del pulso eléctrico generado varía con la trayectoria de la partícula a través de la abertura. Pueden producirse artefactos de señal si la densidad del campo eléctrico varía a lo largo del diámetro de la abertura. Esta variación es resultado tanto de la constricción física del campo eléctrico como del hecho de que la velocidad del líquido varía en función de la ubicación radial en la abertura. En el formato de celda de flujo, este efecto se minimiza ya que el flujo envolvente garantiza que cada partícula recorra una trayectoria casi idéntica a través de la celda de flujo. En el formato de abertura, se pueden utilizar algoritmos de procesamiento de señales para corregir los artefactos resultantes de la trayectoria de las partículas.
Las partículas conductoras son un problema común, pero rara vez afectan los resultados de un experimento. Esto se debe a que la diferencia de conductividad entre la mayoría de los materiales conductores y los iones en líquido (denominada potencial de descarga) es tan grande que la mayoría de los materiales conductores actúan como aislantes en un contador Coulter. El voltaje necesario para romper esta barrera de potencial se denomina voltaje de ruptura. Para aquellos materiales altamente conductores que presentan un problema, el voltaje utilizado durante un experimento Coulter se puede reducir por debajo del potencial de ruptura (que se puede determinar empíricamente).
El principio de Coulter mide el volumen de un objeto, ya que la perturbación en el campo eléctrico es proporcional al volumen de electrolito desplazado por la abertura. Esto genera cierta confusión entre quienes están acostumbrados a las mediciones ópticas con microscopios u otros sistemas que solo ven dos dimensiones y también muestran los límites de un objeto. El principio de Coulter, por otro lado, mide tres dimensiones y el volumen desplazado por un objeto.
El contador Coulter, inventado por Wallace Coulter, aplica una corriente continua (CC) para contar partículas (células) y produce pulsos eléctricos de amplitud dependiente del tamaño de las células. Las células pueden modelarse como aislantes eléctricos rodeados de un líquido conductor que bloquea una parte del camino eléctrico, aumentando así la resistencia medida momentáneamente. Este es el sistema de medición más común que utiliza el principio de Coulter.
Los desarrollos posteriores permitieron ampliar la información obtenida mediante el uso de corriente alterna (CA) para investigar la compleja impedancia eléctrica de las células en lugar de simplemente contar su número. [9] La célula puede entonces modelarse aproximadamente como una membrana celular aislante que rodea el citoplasma de la célula , que es conductor. La delgadez de la membrana celular crea una capacitancia eléctrica entre el citoplasma y el electrolito que rodea la célula. La impedancia eléctrica puede entonces medirse a diferentes frecuencias de CA. A frecuencias bajas (muy por debajo de 1 MHz ) la impedancia es similar a la resistencia de CC. Sin embargo, se pueden utilizar frecuencias más altas en el rango de MHz para investigar el espesor de la membrana celular (que determina su capacitancia). A frecuencias mucho más altas (muy por encima de 10 MHz) la impedancia de la capacitancia de la membrana cae hasta el punto en que la mayor contribución a la impedancia medida proviene del propio citoplasma (la membrana está esencialmente " en cortocircuito "). Por lo tanto, al utilizar diferentes frecuencias, el aparato puede volverse sensible a la estructura interna y la composición de las células.
La aplicación más importante y exitosa del contador Coulter es la caracterización de las células sanguíneas humanas. La técnica se ha utilizado para diagnosticar diversas enfermedades y es el método estándar para obtener recuentos de glóbulos rojos (RBC) y glóbulos blancos (WBC), así como otros parámetros comunes. Cuando se combina con otras tecnologías, como el marcado de fluorescencia y la dispersión de luz, el principio Coulter puede ayudar a producir un perfil detallado de las células sanguíneas de un paciente.
Además del recuento clínico de células sanguíneas (los diámetros de las células suelen ser de 6 a 10 micrómetros), el contador Coulter se ha establecido como el método de laboratorio más confiable para contar una amplia variedad de células, desde bacterias (de tamaño <1 micrómetro), células grasas (alrededor de 400 micrómetros), cuerpos embrionarios de células madre (alrededor de 900 micrómetros) y agregados de células vegetales (>1200 micrómetros).
Los contadores Coulter se han utilizado en una amplia variedad de campos por su capacidad de medir partículas individualmente, independientemente de las propiedades ópticas, la sensibilidad y la confiabilidad. El principio se ha adaptado a la nanoescala para producir técnicas de caracterización de nanopartículas conocidas como detección de pulsos resistivos microfluídicos, así como una empresa comercial que vende una técnica que denomina detección de pulsos resistivos sintonizables (TRPS). La TRPS permite el análisis de alta fidelidad de un conjunto diverso de nanopartículas, incluidas nanopartículas funcionalizadas para administración de fármacos , partículas similares a virus (VLP), liposomas , exosomas , nanopartículas poliméricas y microburbujas .
