Lucy roba la información del Sujeto 16 de Abstergo y se la entrega a Rebecca Crane, quien la introduce en el Animus 2.0 para que Desmond "entrene" en menos tiempo.
Allí, como en Abstergo, los asesinos poseen un Animus, una máquina que permite conocer la vida de tus antepasados volviendo a su época.
Esta vez, Desmond se transporta al Renacimiento, donde conoce a su antepasado, Ezio Auditore Da Firenze.
Ezio Auditore Da Firenze, un joven florentino que vivía la dolce vita a sus 17 años, se encuentra en un momento trágico de su vida, cuando las familias "amigas" de los Auditore conspiran contra su familia y consiguen encarcelarlos.
Años después, Rodrigo Borgia se convierte en Papa, logrando así obtener el poder de la llave que comparte poderes con el "Fruto".
Ezio viaja a Roma, se infiltra en el Vaticano y se abre paso hasta la Capilla Sixtina, allí consigue vencer al poderoso templario, aunque, justo antes de asesinarlo, Borgia consigue zafarse y empuja a Ezio.
Durante el combate, los cuatro asesinos del refugio consiguen huir, al igual que Warren Vidic y los templarios restantes.
La historia concluye con los cuatro asesinos huyendo en una camioneta hacia una cabaña situada en el norte, hablando sobre como ponerse a trabajar para averiguar más información y saber como detener los planes de Abstergo.
Si tienes suficientes florines (dinero) puedes mejorar la villa de tu tío (quien también te enseñará trucos y clases para mejorar tus atributos)lo que te generara ingresos por impuestos que puedes usar para comprar mejores armas y todo lo que se pueda comprar en el comercio como ser medicinas, obras de arte, mejoras con la sastrería que igual aumentaran el valor de la Villa y por lo tanto tus ingresos, solo debes regresar a la Villa a recoger el dinero en el cofre cuando el juego te lo avisa.
El juego cuenta con información histórica de cada personaje y con una misión especial en la que serás el legendario Altair.
En el vídeo la cámara es en primera persona junto a Adán y Eva, quienes escapan con el Fruto del Edén.
Este sistema sacaba al jugador de la partida si desconectaba o perdía su conexión a Internet, por lo que se conservarían únicamente los progresos desde el último punto guardado.