El análisis bacteriológico del agua es un método de análisis del agua para estimar la cantidad de bacterias presentes y, si es necesario, averiguar de qué tipo son. Representa un aspecto de la calidad del agua . Es un procedimiento analítico microbiológico que utiliza muestras de agua y, a partir de ellas, determina la concentración de bacterias. A partir de estas concentraciones, es posible extraer conclusiones sobre la idoneidad del agua para su uso. Este proceso se utiliza, por ejemplo, para confirmar de forma rutinaria que el agua es segura para el consumo humano o que las aguas de baño y de recreo son seguras para su uso.
La interpretación y los niveles de activación de las medidas para las distintas aguas varían en función del uso que se haga de ellas. Mientras que se aplican niveles muy estrictos al agua potable , se aplican niveles más laxos a las aguas de baño marinas, en las que se espera que los usuarios ingieran volúmenes de agua mucho menores.
La característica común de todos estos procedimientos de detección rutinaria es que el análisis principal se centra en los organismos indicadores, no en los patógenos que podrían causar preocupación. Los organismos indicadores son bacterias como los coliformes no específicos , Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, que se encuentran muy comúnmente en el intestino humano o animal y que, si se detectan, pueden sugerir la presencia de aguas residuales . Los organismos indicadores se utilizan porque incluso cuando una persona está infectada con una bacteria más patógena, seguirá excretando muchos millones de veces más organismos indicadores que patógenos. Por lo tanto, es razonable suponer que si los niveles de organismos indicadores son bajos, los niveles de patógenos serán mucho más bajos o inexistentes. Los juicios sobre la idoneidad del agua para su uso se basan en precedentes muy amplios y se relacionan con la probabilidad de que cualquier población de bacterias de muestra pueda ser infecciosa con un nivel estadístico razonable de confianza. [ cita requerida ]
El análisis se realiza generalmente mediante métodos de cultivo , bioquímicos y, a veces, ópticos. Cuando los niveles de organismos indicadores superan los umbrales preestablecidos, se puede realizar un análisis específico de patógenos y detectarlos rápidamente (cuando se sospeche) mediante métodos de cultivo específicos o biología molecular . [1]
Los métodos más fiables son el recuento directo en placa y el método de filtración por membrana. El agar mEndo se utiliza en la filtración por membrana, mientras que el agar VRBA se utiliza en el método de recuento directo en placa. VRBA significa agar bilis rojo violeta. Un medio que contiene sales biliares que promueve el crecimiento de bacterias gramnegativas y tiene características inhibidoras para las bacterias grampositivas, aunque no es completamente inhibidor. [ cita requerida ]
Estos medios contienen lactosa, que normalmente es fermentada por bacterias que fermentan la lactosa y producen colonias que se pueden identificar y caracterizar. Las que fermentan la lactosa producen colonias coloreadas, mientras que las que no fermentan la lactosa producen colonias incoloras. Como el análisis siempre se basa en una muestra muy pequeña tomada de un volumen muy grande de agua, todos los métodos se basan en principios estadísticos. [2]
Uno de los métodos más antiguos se denomina método de tubos múltiples. [3] En este método, una submuestra medida (quizás 10 ml) se diluye con 100 ml de medio de cultivo estéril y luego se decanta una alícuota de 10 ml en cada uno de los diez tubos. Luego se diluyen nuevamente los 10 ml restantes y se repite el proceso. Al final de las 5 diluciones, esto produce 50 tubos que cubren el rango de dilución de 1:10 a 1:10000. [ cita requerida ]
Los tubos se incuban a una temperatura preestablecida durante un tiempo específico y, al final del proceso, se cuenta el número de tubos con crecimiento en cada dilución. Luego, se utilizan tablas estadísticas para derivar la concentración de organismos en la muestra original. Este método se puede mejorar utilizando un medio indicador que cambia de color cuando hay especies formadoras de ácido e incluyendo un pequeño tubo invertido llamado tubo Durham en cada tubo de muestra. El tubo invertido Durham atrapa cualquier gas producido. La producción de gas a 37 grados Celsius es un fuerte indicio de la presencia de Escherichia coli . [ cita requerida ]
Una prueba de ATP es el proceso de medir rápidamente los microorganismos activos en el agua mediante la detección de trifosfato de adenosina (ATP). El ATP es una molécula que se encuentra solo dentro y alrededor de las células vivas y, como tal, proporciona una medida directa de la concentración biológica y la salud. El ATP se cuantifica midiendo la luz producida a través de su reacción con la enzima natural luciferasa de luciérnaga utilizando un luminómetro . La cantidad de luz producida es directamente proporcional a la cantidad de energía biológica presente en la muestra. [ cita requerida ]
Las pruebas de ATP de segunda generación están diseñadas específicamente para aplicaciones de agua, aguas residuales e industriales donde, en su mayoría, las muestras contienen una variedad de componentes que pueden interferir con el ensayo de ATP.
El método de recuento en placa se basa en el crecimiento de colonias bacterianas en un medio nutritivo de modo que la colonia se haga visible a simple vista y se pueda contar el número de colonias en una placa. Para que sea eficaz, la dilución de la muestra original debe organizarse de modo que, en promedio, se cultiven entre 30 y 300 colonias de la bacteria objetivo. Menos de 30 colonias hace que la interpretación sea estadísticamente incorrecta, mientras que más de 300 colonias a menudo da como resultado colonias superpuestas e imprecisiones en el recuento. Para garantizar que se generará un número adecuado de colonias, normalmente se cultivan varias diluciones. Este enfoque se utiliza ampliamente para la evaluación de la eficacia del tratamiento del agua mediante la inactivación de contaminantes microbianos representativos como E. coli siguiendo la norma ASTM D5465. [4] [5]
El procedimiento de laboratorio implica realizar diluciones seriadas de la muestra (1:10, 1:100, 1:1000, etc.) en agua estéril y cultivarlas en agar nutritivo en una placa sellada e incubada. Los medios típicos incluyen agar de recuento en placa para un recuento general o agar MacConkey para contar bacterias Gram-negativas como E. coli . Normalmente, un juego de placas se incuba a 22 °C y durante 24 horas y un segundo juego a 37 °C durante 24 horas. La composición del nutriente generalmente incluye reactivos que resisten el crecimiento de organismos no objetivo y hacen que el organismo objetivo sea fácilmente identificado, a menudo por un cambio de color en el medio. Algunos métodos recientes incluyen un agente fluorescente para que el recuento de las colonias se pueda automatizar. Al final del período de incubación, las colonias se cuentan a simple vista, un procedimiento que lleva unos minutos y no requiere un microscopio, ya que las colonias suelen tener unos pocos milímetros de diámetro. [ cita requerida ]
La mayoría de los laboratorios modernos utilizan un refinamiento del recuento total en placa en el que se filtran al vacío diluciones seriadas de la muestra a través de filtros de membrana hechos a medida y estos filtros se colocan sobre un medio nutritivo dentro de placas selladas. [6] La metodología es similar a los recuentos totales en placa convencionales. Las membranas tienen una cuadrícula milimétrica impresa y se pueden usar de manera confiable para contar el número de colonias con un microscopio binocular. [ cita requerida ]
Cuando el análisis busca especies bacterianas que crecen mal en el aire, el análisis inicial se realiza mezclando diluciones seriadas de la muestra en agar nutritivo líquido que luego se vierte en botellas que luego se sellan y se colocan de lado para producir una superficie de agar inclinada. Las colonias que se desarrollan en el cuerpo del medio se pueden contar a simple vista después de la incubación. [ cita requerida ]
El número total de colonias se denomina recuento viable total (TVC). La unidad de medida es ufc/ml (o unidades formadoras de colonias por mililitro) y se relaciona con la muestra original. Su cálculo es un múltiplo del número de colonias contadas multiplicado por la dilución utilizada. [ cita requerida ]
Cuando las muestras muestran niveles elevados de bacterias indicadoras, se suelen realizar análisis adicionales para buscar bacterias patógenas específicas. Las especies que se investigan habitualmente en la zona templada incluyen Salmonella typhi y Salmonella Typhimurium . Dependiendo de la fuente probable de contaminación, la investigación también puede extenderse a organismos como Cryptosporidium spp . En las zonas tropicales también se realizan análisis de Vibrio cholerae de forma rutinaria. [ cita requerida ]
El agar MacConkey es un medio de cultivo diseñado para cultivar bacterias gramnegativas y teñirlas para la fermentación de la lactosa. Contiene sales biliares (para inhibir la mayoría de las bacterias grampositivas), colorante violeta cristal (que también inhibe ciertas bacterias grampositivas), colorante rojo neutro (que tiñe los microbios que fermentan la lactosa), lactosa y peptona . Alfred Theodore MacConkey lo desarrolló mientras trabajaba como bacteriólogo para la Comisión Real de Eliminación de Aguas Residuales en el Reino Unido .
El agar endo contiene peptona, lactosa, fosfato dipotásico , agar, sulfito de sodio, fucsina básica y fue desarrollado originalmente para el aislamiento de Salmonella typhi , pero ahora se usa comúnmente en el análisis de agua. Al igual que en el agar MacConkey, los organismos coliformes fermentan la lactosa y las colonias se vuelven rojas. Los organismos que no fermentan la lactosa producen colonias transparentes e incoloras contra el fondo rosa pálido del medio. [7]
El medio mFC se utiliza en la filtración por membrana y contiene agentes selectivos y diferenciales, entre ellos el ácido rosólico para inhibir el crecimiento bacteriano en general, excepto los coliformes fecales , las sales biliares inhiben las bacterias no entéricas y el azul de anilina indica la capacidad de los coliformes fecales para fermentar la lactosa a ácido que provoca un cambio de pH en el medio. [8]
El medio TYEA contiene triptona , extracto de levadura , sal común y L-arabinosa por litro de agua destilada y es un medio no selectivo que generalmente se cultiva a dos temperaturas (22 y 36 °C) para determinar un nivel general de contaminación (también conocido como recuento de colonias).
