En microbiología, el término aislamiento se refiere a la separación de una cepa de una población natural mixta de microbios vivos , tal como están presentes en el medio ambiente, por ejemplo en el agua o el suelo , o de seres vivos con flora cutánea , oral o intestinal . para identificar los microbios de interés. [1] Históricamente, las técnicas de laboratorio de aislamiento se desarrollaron por primera vez en el campo de la bacteriología y la parasitología (durante el siglo XIX), antes que las de virología durante el siglo XX.
Las técnicas de laboratorio para aislar microbios se desarrollaron por primera vez durante el siglo XIX en el campo de la bacteriología y la parasitología mediante microscopía óptica . 1860 marcó la exitosa introducción del medio líquido por parte de Louis Pasteur . El cultivo líquido desarrollado por Pasteur permitió visualizar la promoción o inhibición del crecimiento de bacterias específicas. Esta misma técnica se utiliza hoy en día a través de varios medios como el agar manitol salado , un medio sólido. Los cultivos sólidos se desarrollaron en 1881 cuando Robert Koch solidificó los medios líquidos mediante la adición de agar [2]
Antes del siglo XX no existían técnicas virológicas de aislamiento adecuadas. Los métodos de aislamiento microbiano han cambiado drásticamente en los últimos 50 años, desde una perspectiva laboral con una creciente mecanización, y en lo que respecta a las tecnologías involucradas, y con ello la velocidad y precisión.
Para aislar un microbio de una población natural mixta de microbios vivos , como los presentes en el medio ambiente, por ejemplo en la flora del agua o del suelo , o de seres vivos con flora cutánea , oral o intestinal , es necesario separarlo de la mezcla.
Tradicionalmente, los microbios se han cultivado para identificar los microbios de interés en función de sus características de crecimiento. Dependiendo de la densidad esperada y la viabilidad de los microbios presentes en una muestra líquida, se pueden elegir métodos físicos para aumentar el gradiente, como por ejemplo la dilución en serie o la centrifugación . Para aislar organismos en materiales con alto contenido microbiano, como aguas residuales, suelo o heces, las diluciones en serie aumentarán las posibilidades de separar una mezcla.
En un medio líquido con pocos o ningún organismo esperado, desde un área normalmente estéril (como el LCR , sangre dentro del sistema circulatorio), la centrifugación, la decantación del sobrenadante y el uso solo del sedimento aumentarán las posibilidades de crecer y aislar bacterias o generalmente virus asociados a células.
Si uno espera o busca un organismo particularmente exigente , las técnicas de cultivo y aislamiento microbiológico tendrán que orientarse hacia ese microbio. Por ejemplo, una bacteria que muere cuando se expone al aire sólo puede aislarse si la muestra se transporta y procesa en condiciones anaeróbicas o sin aire. Una bacteria que muere cuando se expone a temperatura ambiente (termófila) requiere un recipiente de transporte precalentado, y un microbio que se seca y muere cuando se transporta en un hisopo de algodón necesitará un medio de transporte viral antes de poder cultivarse con éxito.
Los técnicos de laboratorio inoculan la muestra en determinadas placas de agar sólido con el método de la placa en estrías o en medio de cultivo líquido , según cuál sea el objetivo del aislamiento:
Después de inocular la muestra en el medio elegido, se incuba en las condiciones atmosféricas apropiadas, como condiciones aeróbicas, anaeróbicas o microaerófilas o con dióxido de carbono añadido (5%), a diferentes temperaturas, por ejemplo 37 °C en una incubadora o en un refrigerador para el enriquecimiento en frío, bajo la luz adecuada, por ejemplo estrictamente sin luz envuelta en papel o en una botella oscura para las micobacterias escotocromógenas , y durante diferentes períodos de tiempo, porque diferentes bacterias crecen a una velocidad diferente, que varía en horas ( Escherichia coli ) a semanas (por ejemplo, micobacterias ).
A intervalos regulares, los técnicos de laboratorio y los microbiólogos inspeccionan los medios en busca de signos de crecimiento visible y los registran. La inspección también debe realizarse en condiciones que favorezcan la supervivencia del aislado, es decir, en una "cámara anaeróbica" para bacterias anaerobias, por ejemplo, y en condiciones que no pongan en peligro a la persona que mira las placas de ser infectada por un microbio particularmente infeccioso, es decir, bajo una cabina de seguridad biológica para Yersinia pestis (peste) o Bacillus anthracis (ántrax), por ejemplo.
Cuando las bacterias han crecido visiblemente, a menudo todavía están mezcladas. La identificación de un microbio depende del aislamiento de una colonia individual , así como las pruebas bioquímicas de un microbio para determinar sus diferentes características fisiológicas dependen de un cultivo puro . Para hacer un subcultivo , se vuelve a trabajar con una técnica aséptica en microbiología , levantando una sola colonia de la superficie del agar con un asa y esparciendo el material en los 4 cuadrantes de una placa de agar o en todas partes si la colonia era singular y no parecía mezclada. .
La tinción de Gram permite la visualización de la composición de la pared celular de la bacteria en función del color que tiñe la bacteria después de una serie de pasos de tinción y decoloración. [4] Este proceso de tinción permite la identificación de bacterias gramnegativas y grampositivas . Las bacterias gramnegativas se tiñerán de color rosa debido a la fina capa de peptidoglicano. Si una bacteria se tiñe de color púrpura, debido a la gruesa capa de peptidoglicano, la bacteria es una bacteria grampositiva. [4]
En microbiología clínica se utilizan muchas otras técnicas de tinción para organismos particulares (tinción bacteriana acidorresistente para micobacterias). Se han desarrollado técnicas de tinción inmunológica, como la inmunofluorescencia directa , para patógenos de importancia médica que crecen lentamente ( tinción de auramina-rodamina para micobacterias ) o son difíciles de cultivar (como la especie Legionella pneumophila ) y donde el resultado de la prueba alteraría el manejo estándar y la terapia empírica. .
Las pruebas bioquímicas de bacterias implican un conjunto de agares en viales para separar las bacterias móviles de las no móviles . En 1970 se desarrolló una versión miniaturizada, denominada índice de perfil analítico .
La identificación exitosa mediante, por ejemplo, la secuenciación del genoma y la genómica depende de cultivos puros.
Si bien el método más rápido para identificar bacterias es secuenciar su gen 16S rRNA , que ha sido amplificado previamente por PCR, este método no requiere aislamiento. Dado que la mayoría de las bacterias no pueden cultivarse con métodos convencionales (particularmente bacterias ambientales o del suelo), se utilizan metagenómica o metatranscriptómica , secuenciación de escopeta o secuenciación del genoma dirigida por PCR . La secuenciación con espectrometría de masas como en la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) se utiliza en el análisis de muestras clínicas para buscar patógenos. La secuenciación del genoma completo es una opción para un organismo singular que no puede caracterizarse suficientemente para su identificación. También se pueden utilizar pequeños microarrays de ADN para la identificación.