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En biología , un subcultivo es un nuevo cultivo celular o un cultivo microbiológico que se realiza transfiriendo algunas o todas las células de un cultivo anterior a un medio de crecimiento nuevo . Esta acción se denomina subcultivo o transferencia de células. El subcultivo se utiliza para prolongar la vida útil y/o aumentar la cantidad de células o microorganismos en el cultivo. [1]
Las líneas celulares y los microorganismos no pueden mantenerse en cultivo indefinidamente debido al aumento gradual de metabolitos que pueden ser tóxicos , el agotamiento de los nutrientes presentes en el medio de cultivo y un aumento en el recuento celular o el tamaño de la población debido al crecimiento. Una vez que se agotan los nutrientes y aumentan los niveles de subproductos tóxicos, los microorganismos en cultivo entrarán en la fase estacionaria , donde la proliferación se reduce en gran medida o cesa (el valor de la densidad celular se estabiliza). Cuando los microorganismos de este cultivo se transfieren a medios nuevos, los nutrientes desencadenan el crecimiento de los microorganismos que pasarán por una fase de retraso , un período de crecimiento lento y adaptación al nuevo entorno, seguido de una fase logarítmica , un período en el que las células crecen exponencialmente. [1]
Por lo tanto, el subcultivo se utiliza para producir un nuevo cultivo con una densidad de células menor que el cultivo original, nutrientes frescos y sin metabolitos tóxicos que permitan el crecimiento continuo de las células sin riesgo de muerte celular. El subcultivo es importante tanto para las células proliferantes (por ejemplo, un microorganismo como E. coli ) como para las no proliferantes (por ejemplo, glóbulos blancos diferenciados terminalmente ). El subcultivo también se puede utilizar para cálculos de curvas de crecimiento (por ejemplo, tiempo de generación) [2] y para obtener microorganismos en fase logarítmica para experimentos (por ejemplo, transformación bacteriana). [3]
Por lo general, el subcultivo se realiza a partir de un cultivo de un volumen determinado en un medio de crecimiento fresco de igual volumen, lo que permite el mantenimiento a largo plazo de la línea celular. El subcultivo en un volumen mayor de medio de crecimiento se utiliza cuando se desea aumentar la cantidad de células para, por ejemplo, su uso en un proceso industrial o un experimento científico.
A menudo es importante registrar el número aproximado de divisiones que han tenido las células en cultivo, registrando el número de pases o subcultivos. En el caso de las células de tejido vegetal , la variación somaclonal puede surgir durante largos períodos de cultivo. De manera similar, en las líneas celulares de mamíferos , las aberraciones cromosómicas tienden a aumentar con el tiempo. En el caso de los microorganismos, existe una tendencia a adaptarse a las condiciones de cultivo, que rara vez son exactamente iguales a su entorno natural, lo que puede alterar su biología.
El protocolo para subcultivar células depende en gran medida de las propiedades de las células involucradas.
Muchos tipos de células, en particular muchos microorganismos, crecen en solución y no adheridos a una superficie. Estos tipos de células se pueden subcultivar simplemente tomando un pequeño volumen del cultivo original y diluyéndolo en un medio de crecimiento fresco. La densidad celular en estos cultivos normalmente se mide en células por mililitro para células eucariotas grandes, o como densidad óptica para luz de 600 nm para células más pequeñas como las bacterias. Las células a menudo tendrán un rango preferido de densidades para un crecimiento óptimo y el subcultivo normalmente intentará mantener las células en este rango.
Las células adherentes, por ejemplo, muchas líneas celulares de mamíferos, crecen adheridas a una superficie como el fondo de un matraz de cultivo celular o una placa de Petri. Estos tipos de células deben desprenderse de la superficie antes de que puedan subcultivarse. Para las células adherentes, la densidad celular normalmente se mide en términos de confluencia , el porcentaje de la superficie de crecimiento cubierta por células. Las células a menudo tendrán un rango conocido de confluencias para un crecimiento óptimo, por ejemplo, una línea celular de mamíferos como HeLa generalmente prefiere confluencias entre el 10% y el 100%, y el subcultivo normalmente intentará mantener las células en este rango. Para el subcultivo, las células pueden desprenderse mediante uno de varios métodos, incluido el tratamiento con tripsina para descomponer las proteínas responsables de la adherencia a la superficie, la quelación de iones de calcio con EDTA que altera algunos mecanismos de adherencia de proteínas o métodos mecánicos como el lavado repetido o el uso de un raspador de células. Luego, las células desprendidas se resuspenden en medio de crecimiento fresco y se dejan asentar nuevamente sobre su superficie de crecimiento.