La tripsina es una enzima de la primera sección del intestino delgado que inicia la digestión de las moléculas de proteínas cortando largas cadenas de aminoácidos en trozos más pequeños. Es una serina proteasa de la superfamilia del clan PA , que se encuentra en el sistema digestivo de muchos vertebrados , donde hidroliza las proteínas . [2] [3] La tripsina se forma en el intestino delgado cuando se activa su forma proenzimática , el tripsinógeno producido por el páncreas . La tripsina corta las cadenas de péptidos principalmente en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina . Se utiliza para numerosos procesos biotecnológicos . El proceso se conoce comúnmente como proteólisis del tripsinógeno o tripsinización , y se dice que las proteínas que han sido digeridas/tratadas con tripsina han sido tripsinizadas. [4]
La tripsina fue descubierta en 1876 por Wilhelm Kühne . [5] Aunque muchas fuentes dicen que Kühne nombró a la tripsina de la palabra griega antigua para frotar, 'tripsis', porque la enzima fue aislada por primera vez frotando el páncreas con polvo de vidrio y alcohol, de hecho Kühne nombró a la tripsina de la palabra griega antigua 'thrýpto' que significa 'rompo' o 'rompo en pedazos'. [6]
En el duodeno , la tripsina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos , descomponiendo las proteínas en péptidos más pequeños. Los productos peptídicos se hidrolizan luego en aminoácidos a través de otras proteasas, lo que los hace disponibles para su absorción en el torrente sanguíneo. La digestión tripsínica es un paso necesario en la absorción de proteínas, ya que las proteínas generalmente son demasiado grandes para ser absorbidas a través del revestimiento del intestino delgado . [7]
La tripsina se produce como el zimógeno inactivo tripsinógeno en el páncreas. Cuando el páncreas es estimulado por la colecistoquinina , se secreta en la primera parte del intestino delgado (el duodeno ) a través del conducto pancreático . Una vez en el intestino delgado, la enzima enteroquinasa (también llamada enteropeptidasa) activa el tripsinógeno en tripsina por escisión proteolítica . La tripsina luego activa tripsina, quimotripsina y carboxipeptidasa adicionales .
El mecanismo enzimático es similar al de otras proteasas de serina. Estas enzimas contienen una tríada catalítica que consiste en histidina -57, aspartato -102 y serina -195. [8] Esta tríada catalítica se llamaba anteriormente un sistema de relevo de carga, lo que implica la abstracción de protones de serina a histidina y de histidina a aspartato, pero debido a la evidencia proporcionada por RMN de que la forma alcóxido resultante de serina tendría una atracción mucho más fuerte sobre el protón que el anillo de imidazol de histidina, el pensamiento actual sostiene en cambio que la serina y la histidina tienen cada una efectivamente una proporción igual del protón, formando enlaces de hidrógeno cortos de baja barrera con el mismo. [9] [ página necesaria ] Por estos medios, la nucleofilicidad de la serina del sitio activo aumenta, lo que facilita su ataque al carbono amida durante la proteólisis. La reacción enzimática que cataliza la tripsina es termodinámicamente favorable, pero requiere una energía de activación significativa (es " cinéticamente desfavorable"). Además, la tripsina contiene un "agujero de oxianión" formado por los átomos de hidrógeno de la amida de la cadena principal de Gly-193 y Ser-195, que a través de enlaces de hidrógeno estabilizan la carga negativa que se acumula en el oxígeno de la amida después del ataque nucleofílico sobre el carbono de la amida plana por el oxígeno de la serina hace que ese carbono asuma una geometría tetraédrica. Tal estabilización de este intermediario tetraédrico ayuda a reducir la barrera energética de su formación y es concomitante con una disminución de la energía libre del estado de transición. La unión preferencial del estado de transición es una característica clave de la química enzimática.
El residuo aspartato negativo (Asp 189) ubicado en el bolsillo catalítico (S1) de la tripsina es responsable de atraer y estabilizar la lisina y/o arginina cargadas positivamente y, por lo tanto, es responsable de la especificidad de la enzima. Esto significa que la tripsina escinde proteínas predominantemente en el lado carboxilo (o " lado C-terminal ") de los aminoácidos lisina y arginina excepto cuando alguno está unido a una prolina C-terminal , [10] aunque los datos de espectrometría de masas a gran escala sugieren que la escisión ocurre incluso con prolina. [11] La tripsina se considera una endopeptidasa , es decir, la escisión ocurre dentro de la cadena polipeptídica en lugar de en los aminoácidos terminales ubicados en los extremos de los polipéptidos .
La tripsina humana tiene una temperatura de funcionamiento óptima de aproximadamente 37 °C. [12] En cambio, el bacalao del Atlántico tiene varios tipos de tripsinas para que el pez poiquilotermo sobreviva a diferentes temperaturas corporales. Las tripsinas del bacalao incluyen la tripsina I con un rango de actividad de 4 a 65 °C (39 a 149 °F) y una actividad máxima a 55 °C (131 °F), así como la tripsina Y con un rango de 2 a 30 °C (36 a 86 °F) y una actividad máxima a 21 °C (70 °F). [13]
Como proteína, la tripsina tiene distintos pesos moleculares según la fuente. Por ejemplo, se ha informado de un peso molecular de 23,3 kDa para la tripsina de origen bovino y porcino.
La actividad de la tripsina no se ve afectada por el inhibidor enzimático tosil fenilalanil clorometil cetona, TPCK , que desactiva la quimotripsina .
La tripsina debe almacenarse a temperaturas muy frías (entre −20 y −80 °C) para evitar la autólisis , que también puede verse impedida por el almacenamiento de tripsina a un pH de 3 o por el uso de tripsina modificada por metilación reductora. Cuando el pH se ajusta nuevamente a pH 8, la actividad regresa.
Estos genes humanos codifican proteínas con actividad enzimática tripsina:
También pueden encontrarse otras isoformas de tripsina en otros organismos.
La activación de la tripsina a partir de la escisión proteolítica del tripsinógeno en el páncreas puede conducir a una serie de eventos que causan la autodigestión pancreática, lo que resulta en pancreatitis . Una consecuencia de la enfermedad autosómica recesiva fibrosis quística es una deficiencia en el transporte de tripsina y otras enzimas digestivas desde el páncreas. Esto conduce al trastorno denominado íleo meconial , que implica una obstrucción intestinal ( íleo ) debido a un meconio demasiado espeso , que normalmente se descompone por la tripsina y otras proteasas, y luego se elimina en las heces. [14]
La tripsina se encuentra disponible en grandes cantidades en el páncreas y se puede purificar con relativa facilidad, por lo que se ha utilizado ampliamente en diversos procesos biotecnológicos.
En un laboratorio de cultivo de tejidos , la tripsina se utiliza para resuspender las células adheridas a la pared de la placa de cultivo celular durante el proceso de recolección de células. [15] Algunos tipos de células se adhieren a los lados y al fondo de una placa cuando se cultivan in vitro . La tripsina se utiliza para escindir las proteínas que sujetan las células cultivadas a la placa, de modo que las células se puedan retirar de las placas.
La tripsina también se puede utilizar para disociar células disecadas (por ejemplo, antes de la fijación y clasificación celular).
La tripsina se puede utilizar para descomponer la caseína presente en la leche materna. Si se añade tripsina a una solución de leche en polvo, la descomposición de la caseína hace que la leche se vuelva translúcida . La velocidad de la reacción se puede medir utilizando la cantidad de tiempo que necesita la leche para volverse translúcida.
La tripsina se utiliza habitualmente en la investigación biológica durante los experimentos de proteómica para digerir proteínas y convertirlas en péptidos para su análisis por espectrometría de masas, por ejemplo, en la digestión en gel . La tripsina es especialmente adecuada para este fin, ya que tiene una especificidad muy bien definida, ya que hidroliza únicamente los enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo es aportado por un residuo de arginina o lisina.
La tripsina también se puede utilizar para disolver coágulos de sangre en su forma microbiana y tratar la inflamación en su forma pancreática.
En medicina veterinaria, la tripsina es un ingrediente de los productos en aerosol para heridas, como Debrisol, para disolver el tejido muerto y el pus en heridas en caballos, ganado, perros y gatos. [16]
Las preparaciones comerciales de proteasas suelen consistir en una mezcla de varias enzimas proteasas que a menudo incluyen tripsina. Estas preparaciones se utilizan ampliamente en el procesamiento de alimentos: [17]
Para evitar la acción de la tripsina activa en el páncreas, que puede ser muy dañina, se utilizan inhibidores como BPTI y SPINK1 en el páncreas y α1-antitripsina en el suero como parte de la defensa contra su activación inapropiada. La tripsina formada prematuramente a partir del tripsinógeno inactivo se une al inhibidor. La interacción proteína-proteína entre la tripsina y sus inhibidores es una de las más estrechas, y la tripsina se une a algunos de sus inhibidores pancreáticos de forma casi irreversible. [18] A diferencia de casi todos los conjuntos proteicos conocidos, algunos complejos de tripsina unidos a sus inhibidores no se disocian fácilmente después del tratamiento con urea 8M. [19]
Los inhibidores de tripsina pueden servir como herramientas para abordar los trastornos metabólicos y la obesidad. Se sabe que los trastornos metabólicos, la obesidad y el sobrepeso aumentan la prevalencia de enfermedades crónicas no transmisibles. [20] Es de interés para las políticas de salud pública explorar diversas formas de mitigar esta incidencia, incluido el uso de inhibidores de tripsina. Estos inhibidores tienen la capacidad de reducir el cáncer de colon, mama, piel y próstata mediante una actividad radioprotectora y anticancerígena. Los inhibidores de tripsina pueden actuar como mecanismos reguladores para controlar la liberación de proteasas de neutrófilos y evitar un daño tisular significativo. [20] En lo que respecta a las afecciones cardiovasculares asociadas con la actividad improductiva de la serina proteasa, los inhibidores de tripsina pueden bloquear su actividad en la agregación plaquetaria, la fibrinólisis, la coagulación y la coagulación sanguínea.
La multifuncionalidad de los inhibidores de tripsina incluye ser inhibidores potenciales de proteasas para la actividad de AMP. [21] Si bien los mecanismos de acción antibacteriana de los inhibidores de tripsina no están claros, los estudios han tenido como objetivo estudiar sus mecanismos como posibles aplicaciones en tratamientos de infecciones bacterianas. [21] La investigación y la microscopía de barrido mostraron efectos antibacterianos en las membranas bacterianas de Staphylococcus aureus . [21] Los inhibidores de tripsina de la piel de anfibios mostraron una promoción de la muerte bacteriana que afectó la pared celular y la membrana de Staphylococcus aureus . [21] Los estudios también analizaron acciones antibacterianas en péptidos inhibidores de tripsina, proteínas y E. coli . Los resultados mostraron una prevención suficiente del crecimiento bacteriano. Sin embargo, los inhibidores de tripsina deben cumplir ciertos criterios para ser utilizados en alimentos y tratamientos médicos. [21]
La digestión con tripsina de la matriz extracelular es una práctica común en los cultivos celulares. Sin embargo, esta degradación enzimática de las células puede afectar negativamente la viabilidad celular y los marcadores de superficie, especialmente en las células madre. Existen alternativas más suaves que la tripsina, como Accutase, que no afecta a los marcadores de superficie como CD14, CD117, CD49f, CD292. [22] [23] Sin embargo, Accutase disminuye los niveles de superficie de FasL y el receptor Fas en los macrófagos , estos receptores están asociados con la citotoxicidad celular en el sistema inmunológico y también pueden facilitar la muerte celular relacionada con la apoptosis . [24]
La proalanasa también podría servir como una alternativa a la tripsina en aplicaciones proteómicas. [25] La proalanasa es una proteasa del hongo Aspergillus niger que puede lograr una alta actividad proteolítica y especificidad para la digestión en las condiciones adecuadas. [25] La proanalasa, la proteasa prolil-endopeptidasa ácida, estudiada previamente como An-PEP, se ha observado en varios experimentos para definir su especificidad. [25] La proanalasa funcionó de manera óptima en aplicaciones LC-MS con tiempos de digestión cortos y pH altamente ácido. [25]
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