La fenilalanina hidroxilasa ( PAH ) ( EC 1.14.16.1) es una enzima que cataliza la hidroxilación de la cadena lateral aromática de la fenilalanina para generar tirosina . PAH es uno de los tres miembros de las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos dependientes de biopterina , una clase de monooxigenasa que utiliza tetrahidrobiopterina (BH 4 , un cofactor de pteridina ) y un hierro no hemo para la catálisis. Durante la reacción, el oxígeno molecular se escinde heterolíticamente con la incorporación secuencial de un átomo de oxígeno al BH 4 y al sustrato de fenilalanina. [5] [6] En los seres humanos, las mutaciones en su gen codificante, PAH , pueden provocar el trastorno metabólico fenilcetonuria .
Se cree que la reacción se desarrolla mediante los siguientes pasos:
Formación y escisión del puente hierro-peroxipterina. Aunque la evidencia apoya firmemente al Fe(IV)=O como intermediario hidroxilante, [8] los detalles mecanísticos subyacentes a la formación del puente Fe(II)-OO-BH 4 antes de la escisión heterolítica siguen siendo controvertidos. Se han propuesto dos vías basadas en modelos que difieren en la proximidad del hierro al cofactor pterina y el número de moléculas de agua que se supone están coordinadas con el hierro durante la catálisis. Según un modelo, inicialmente se forma y estabiliza un complejo de hierro-dioxígeno como un híbrido de resonancia de Fe 2+ O 2 y Fe 3+ O 2 − . El O 2 activado luego ataca al BH 4 , formando un estado de transición caracterizado por la separación de carga entre el anillo de pterina deficiente en electrones y las especies de dioxígeno ricas en electrones. [9] Posteriormente se forma el puente Fe(II)-OO-BH 4 . Por otro lado, la formación de este puente se ha modelado asumiendo que BH4 está ubicado en la primera capa de coordinación del hierro y que el hierro no está coordinado con ninguna molécula de agua. Este modelo predice un mecanismo diferente que involucra un radical pterina y superóxido como intermediarios críticos. [10] Una vez formado, el puente Fe(II)-OO-BH 4 se rompe mediante escisión heterolítica del enlace OO a Fe(IV)=O y 4a-hidroxitetrahidrobiopterina; por tanto, el oxígeno molecular es la fuente de ambos átomos de oxígeno utilizados para hidroxilar el anillo de pterina y la fenilalanina.
Hidroxilación de fenilalanina por el intermedio ferril oxo. Debido a que el mecanismo implica un intermedio hidroxilante de Fe(IV)=O (a diferencia de una peroxipterina), la oxidación del cofactor BH 4 y la hidroxilación de la fenilalanina pueden desacoplarse, lo que resulta en un consumo improductivo de BH 4 y la formación de H 2 O 2 . [7] Sin embargo, cuando es productivo, el intermedio Fe(IV)=O se añade a la fenilalanina en una reacción de sustitución aromática electrófila que reduce el hierro del ferry al estado ferroso. [7] Aunque inicialmente se propuso un óxido de areno o un intermediario radical, los análisis de las tirosina hidroxilasas relacionadas de triptófano y tirosina han sugerido que la reacción se desarrolla a través de un intermediario catiónico que requiere que Fe(IV)=O esté coordinado con un ligando de agua en lugar de un grupo hidroxo. [7] [11] Este intermedio catiónico posteriormente sufre un cambio NIH de 1,2-hidruro, lo que produce un intermedio de dienona que luego se tautomeriza para formar el producto de tirosina. [12] El cofactor pterina se regenera mediante la hidratación del producto carbinolamina de la PAH a la quinonoide dihidrobiopterina (qBH 2 ), que luego se reduce a BH 4 . [13]
Se propone que PAH utilice el modelo de regulación alostérica de morfeína . [14] [15]
Los HAP de mamíferos existen en un equilibrio que consta de tetrámeros de dos arquitecturas distintas, con una o más formas diméricas como parte del equilibrio. Este comportamiento es consistente con un mecanismo alostérico disociativo. [15]
Muchos estudios sugieren que la PAH de los mamíferos muestra un comportamiento comparable al de la porfobilinógeno sintasa (PBGS), en el que se informa que una variedad de factores como el pH y la unión del ligando afectan la actividad enzimática y la estabilidad de las proteínas. [15]
El monómero PAH (51,9 kDa) consta de tres dominios distintos: un dominio N-terminal regulador (residuos 1 a 117) que contiene un subdominio ACT de unión a Phe, el dominio catalítico (residuos 118 a 427) y un dominio C-terminal. (residuos 428–453) responsables de la oligomerización de monómeros idénticos. Se han realizado análisis cristalográficos exhaustivos, especialmente en el dominio catalítico coordinado por pterina y hierro para examinar el sitio activo. También se ha determinado la estructura del dominio regulador N-terminal y, junto con la estructura resuelta del dominio de tetramerización C-terminal de la tirosina hidroxilasa homóloga, se propuso un modelo estructural de PAH tetramérico. [13] Utilizando cristalografía de rayos X, se determinó experimentalmente la estructura de la PAH de rata de longitud completa y mostró la forma autoinhibida o en estado de reposo de la enzima. [16] La forma en estado de reposo (RS-PAH) es arquitectónicamente distinta de la forma activada (A-PAH). [17] Actualmente falta una estructura completa de A-PAH, pero se ha determinado la interfaz ACT-ACT estabilizada con Phe que es característica de A-PAH y se ha propuesto un modelo estructural de A-PAH basado en el análisis SAXS. [18] [19]
Las estructuras cristalinas resueltas del dominio catalítico indican que el sitio activo consiste en una bolsa abierta y espaciosa revestida principalmente por residuos hidrofóbicos, aunque también están presentes tres residuos de ácido glutámico, dos histidinas y una tirosina que se unen al hierro. [13] Existe evidencia contradictoria sobre el estado de coordinación del átomo ferroso y su proximidad a BH4 dentro del sitio activo. Según el análisis cristalográfico, el Fe (II) está coordinado por agua, His285, His290 y Glu330 (una tríada facial de 2-his-1-carboxilato) con geometría octaédrica. [20] La inclusión de un análogo de Phe en la estructura cristalina cambia el hierro de un estado coordinado de seis a cinco que involucra una sola molécula de agua y una coordinación bidentada a Glu330 y abre un sitio para que se una el oxígeno. BH4 se desplaza simultáneamente hacia el átomo de hierro, aunque el cofactor pterina permanece en la segunda esfera de coordinación. [21] Por otro lado, un modelo competitivo basado en RMN y análisis de modelos moleculares sugiere que todas las moléculas de agua coordinadas son expulsadas del sitio activo durante el ciclo catalítico, mientras que el BH4 se coordina directamente con el hierro. [22] Como se analizó anteriormente, resolver esta discrepancia será importante para determinar el mecanismo exacto de la catálisis de la HAP.
La naturaleza reguladora del dominio N-terminal (residuos 1 a 117) la confiere su flexibilidad estructural. [23] El análisis de los intercambios de hidrógeno/deuterio indica que la unión alostérica de Phe altera globalmente la conformación de PAH de modo que el sitio activo está menos ocluido a medida que la interfaz entre los dominios regulador y catalítico está cada vez más expuesta al disolvente. [23] [24] [25] Esta observación es consistente con los estudios cinéticos, que muestran una tasa inicialmente baja de formación de tirosina para la HAP de longitud completa. Sin embargo, este tiempo de retraso no se observa para una PAH truncada que carece del dominio N-terminal o si la enzima de longitud completa se preincuba con Phe. La eliminación del dominio N-terminal también elimina el tiempo de retraso al tiempo que aumenta la afinidad por Phe casi el doble; no se observa diferencia en el Vmax o Km para el cofactor de tetrahidrobiopterina. [26] Ser16 proporciona regulación adicional; La fosforilación de este residuo no altera la conformación de la enzima pero sí reduce la concentración de Phe necesaria para la activación alostérica. [25] Este dominio regulador N-terminal no se observa en los HAP bacterianos, pero muestra una homología estructural considerable con el dominio regulador de la fosfogilcerato deshidrogenasa, una enzima en la vía biosintética de la serina. [25]
La HAP procariótica es monomérica, mientras que la HAP eucariota existe en un equilibrio entre formas homotetraméricas y homodiméricas. [7] [13] La interfaz de dimerización está compuesta de bucles relacionados con la simetría que unen monómeros idénticos, mientras que el dominio de tetramerización C-terminal superpuesto media la asociación de dímeros conformacionalmente distintos que se caracterizan por una orientación relativa diferente de los dominios catalíticos y de tetramerización. (Flatmark, Erlandsen). La distorsión resultante de la simetría del tetrámero es evidente en el área de superficie diferencial de las interfaces de dimerización y distingue a los PAH de la tirosina hidroxilasa tetraméricamente simétrica. [13] Se ha propuesto un mecanismo de intercambio de dominios para mediar la formación del tetrámero a partir de dímeros, en el que las hélices alfa C-terminales alteran mutuamente su conformación alrededor de una región bisagra flexible de cinco residuos C-terminal para formar una estructura en espiral. , desplazando el equilibrio hacia la forma tetramérica. [7] [13] [27] Aunque tanto la forma homodimérica como la homotetramérica de PAH son catalíticamente activas, las dos exhiben una cinética y regulación diferenciales. Además de una eficiencia catalítica reducida, el dímero no muestra cooperatividad positiva hacia la L-Phe (que en altas concentraciones activa la enzima), lo que sugiere que la L-Phe regula alostéricamente la HAP al influir en la interacción dímero-dímero. [27]
La PAH es una enzima crítica en el metabolismo de la fenilalanina y cataliza el paso limitante de la velocidad en su catabolismo completo a dióxido de carbono y agua. [13] [28] La regulación del flujo a través de las vías asociadas a la fenilalanina es fundamental en el metabolismo de los mamíferos, como lo demuestra la toxicidad de los altos niveles plasmáticos de este aminoácido observado en la fenilcetonuria (ver más abajo). La principal fuente de fenilalanina son las proteínas ingeridas, pero relativamente una pequeña cantidad de esta reserva se utiliza para la síntesis de proteínas. [28] En cambio, la mayor parte de la fenilalanina ingerida se cataboliza a través de HAP para formar tirosina ; La adición del grupo hidroxilo permite que el anillo de benceno se rompa en pasos catabólicos posteriores. La transaminación a fenilpiruvato , cuyos metabolitos se excretan en la orina, representa otra vía de recambio de fenilalanina, pero predomina el catabolismo a través de PAH. [28]
En los seres humanos, esta enzima se expresa tanto en el hígado como en el riñón, y hay algunos indicios de que puede estar regulada de manera diferencial en estos tejidos. [29] La HAP es inusual entre las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos por su participación en el catabolismo; Las tirosina y triptófano hidroxilasas , por otro lado, se expresan principalmente en el sistema nervioso central y catalizan pasos limitantes de la velocidad en la biosíntesis de neurotransmisores/hormonas. [13]
La deficiencia en la actividad de la PAH debido a mutaciones en la PAH causa hiperfenilalaninemia (HPA), y cuando los niveles de fenilalanina en sangre aumentan por encima de 20 veces la concentración normal, se produce la enfermedad metabólica fenilcetonuria (PKU). [28] La PKU es genotípica y fenotípicamente heterogénea: se han identificado más de 300 variantes patogénicas distintas, la mayoría de las cuales corresponden a mutaciones sin sentido que se asignan al dominio catalítico. [13] [20] Cuando una cohorte de mutantes de PAH identificados se expresó en sistemas recombinantes, las enzimas mostraron un comportamiento cinético alterado y/o una estabilidad reducida, lo que es consistente con el mapeo estructural de estas mutaciones en los dominios catalíticos y de tetramerización de la enzima. [13] BH4 4 se ha administrado como tratamiento farmacológico y se ha demostrado que reduce los niveles sanguíneos de fenilalanina en un segmento de pacientes con PKU cuyos genotipos conducen a cierta actividad residual de PAH pero no tienen defectos en la síntesis o regeneración de BH4 4 . Los estudios de seguimiento sugieren que en el caso de ciertos mutantes de PAH, el exceso de BH4 4 actúa como un acompañante farmacológico para estabilizar las enzimas mutantes con un ensamblaje de tetrámero interrumpido y una mayor sensibilidad a la escisión y agregación proteolítica. [30] Las mutaciones que se han identificado en el locus PAH están documentadas en la base de conocimiento del locus fenilalanina hidroxilasa (PAHdb, https://web.archive.org/web/20130718162051/http://www.pahdb.mcgill.ca/) .
Dado que la fenilcetonuria puede causar daños irreversibles, es imperativo que las deficiencias de fenilalanina hidroxilasa se determinen en las primeras etapas del desarrollo. Originalmente, esto se hacía mediante un ensayo de inhibición bacteriana conocido como prueba de Guthrie . Ahora, la PKU forma parte del examen de detección de recién nacidos en muchos países, y los niveles elevados de fenilalanina se identifican poco después del nacimiento mediante mediciones con espectrometría de masas en tándem . Someter al individuo a una dieta baja en fenilalanina y alta en tirosina puede ayudar a prevenir cualquier daño a largo plazo en su desarrollo.
El primer intento de crear un modelo de ratón Pah -KO se informó en un artículo de investigación publicado en 2021. [31] Este ratón knockout se creó para ser homocigótico a través de su desarrollo dentro de la cepa C57BL/6 J utilizando CRISPR / Cas9 . [32] El codón 7, GAG, en el gen Pah se alteró al codón de parada TAG, lo que representa una mutación puntual intencional . Se estudiaron ratones homocigotos machos de dos a seis meses de edad mediante métodos científicos como ensayos bioquímicos y de comportamiento, resonancia magnética e histopatología. Los ratones homocigotos se compararon de forma rutinaria con ratones de control, ratones Pah -KO heterocigotos de la misma edad y sexo que expresaban suficiente actividad enzimática PAH para suministrar niveles de fenilalanina y tirosina similares a los de los ratones de tipo salvaje .
El modelo de ratón Pah -KO presentó niveles elevados de fenilalanina en sangre y bajos de tirosina, hipocolesterolemia , niveles elevados de fenilalanina y bajos de neurotransmisores y tirosina en el cerebro, hipomielinización, bajo peso cerebral y corporal, alto grado de patología ocular, hipopigmentación y un comportamiento progresivo. déficit en comparación con ratones heterocigotos. [31] Después de la terminación de los ratones homocigotos, no se detectaron proteínas hepáticas de PAH mediante análisis de transferencia Western . [33] La mayor cantidad de fenilalanina en homogeneizados de cerebro completo de ratones homocigotos fue similar a la de los pacientes con PKU. El color del pelaje de ambos ratones dependía de la cantidad de pigmento de melanina en los tallos del cabello; por lo tanto, los ratones homocigotos eran propensos a tener un color marrón más claro debido a la menor melanina presente. El comportamiento de los ratones se probó con un ensayo de construcción de nidos. [31]
Este modelo abre el potencial para una investigación exhaustiva de la biología de la PKU que se asemeja a los pacientes con PKU y para la evaluación de estrategias terapéuticas modernas para el tratamiento de la PKU.
La fenilalanina hidroxilasa está estrechamente relacionada con otras dos enzimas:
Las tres enzimas son homólogas, es decir, se cree que evolucionaron a partir de la misma antigua hidroxilasa.
