[2]​[3]​ Desde muy pequeño vivió en Tavullia, donde comenzó su vida en el deporte de motor corriendo en los karts apoyado por su padre Graziano.

Los altos costos de seguir este camino lo obligaron a quedarse en las mini motos con las que ganó el campeonato regional en 1992.

Para 1998 Rossi pasa a la categoría de 250 cc, pilotando otra vez para Aprilia junto a Loris Capirossi y el japonés Tetsuya Harada, en esta temporada termina 23 puntos atrás del campeón, su compañero Loris Capirossi.

En el año 2000 debutó en los 500 cc pilotando la Honda NSR500, quedó segundo en el campeonato a 49 puntos de Kenny Roberts Jr.

Al final de esta temporada se supo que Rossi había fichado por la marca rival de Honda: Yamaha, debido a las diferencias que tenía HRC con Rossi.

En 2004 Rossi, tras dejar Honda, la moto ganadora, compitió para Yamaha, ganando 9 carreras y consiguiendo el título.

No solo ganó el título en su primer año en Yamaha, la marca de los diapasones venía de una importante sequía, sino que obtuvo una doble victoria moral alzándose en lo más alto del podio en la prueba inaugural en el circuito de Welkom sobre sus dos máximos rivales ese años, Max Biaggi y Sete Gibernau, quienes llevaban monturas Honda.

Junto con lo anterior, Valentino se convirtió en el único piloto hasta la fecha en ganar dos carreras seguidas con diferentes marcas, en la carrera final del campeonato en Cheste y en la prueba inaugural del campeonato 2004, Welkom.

La temporada 2006 sería muy irregular para Rossi en la cual se disputaría el título con el estadounidense Nicky Hayden.

Rossi llegaría a Valencia con opciones de ganar el título pero una inesperada caída tras salir desde la pole le dejó sin opciones de ser campeón aunque finalizó la carrera en los puntos cediéndole el título a Hayden.

En el Gran Premio de Japón Rossi está en la 13.ª posición y Casey Stoner es proclamado campeón.

Tras ser segundo en Australia, ganar la carrera en Malasia y quedar tercero en Valencia, Rossi, con 373 puntos supera el récord de la mayor cantidad de puntos obtenidos en una sola temporada.

Fue enviado en helicóptero al Hospital de Florencia, donde sería operado esa misma tarde.

Su séptimo puesto final solo le sitúa por delante del noveno de su temporada mundialista como debutante en 1996.

Rossi comenzó bien la temporada, obtuvo ocho podios, antes de conseguir su primera victoria del año en Misano.

Este es el año en el que Rossi estuvo más cerca de conseguir su décimo título desde su regreso a Yamaha.

Ambos pilotos mantenían una buena relación que se deterioró a lo largo del año por culpa de incidentes como los ocurridos en el Gran premio de Argentina[12]​ y en el de Holanda en el que en la última chicana llegaron a tocarse y en la que el italiano acabaría llevándose la victoria tras hacer un recto.

A pesar de lo incidentes en las primeras 12 fechas de la temporada, Rossi logró estar en el podio en todas, destacando cuatro victorias en Catar, Argentina, Países Bajos y Gran Bretaña.

Durante la penúltima carrera en Sepang Marc Márquez, sin posibilidades de ganar el campeonato y a pesar de salir desde la pole, acabó enzarzandose en una batalla por la tercera posición con Rossi.

[15]​ Esta medida ponía el título en bandeja a Lorenzo que solo debía remontar siete puntos al italiano.

Al esperar un comienzo difícil en la temporada con los nuevos neumáticos, Rossi pudo ajustarse como lo dijo a los medios en Sepang.

Rossi comenzó la temporada 2016 con el cuarto puesto en Catar, aunque a solo dos segundos de la victoria.

Rossi se recuperó en Cataluña al ganar desde la séptima posición en la primera vuelta después de una carrera final con Márquez.

Asumiendo el liderato en la segunda carrera, Rossi marcó la vuelta más rápida, pero continuó empujando antes de estrellarse debido a lo que llamó un "error estúpido".

Rossi volvió a liderar durante un período en Aragón antes de terminar finalmente tercero.

Rossi comenzó el 15 en Phillip Island después de que la lluvia afectó a la clasificación, pero se recuperó para terminar segundo en la carrera.

Rossi quedaría en segunda posición en condiciones de humedad en Sepang, detrás de Andrea Dovizioso, quien volvió a liderar por períodos, y el resultado que obtuvo le aseguró el subcampeónato en el mundial por tercer año consecutivo.

Participó también en el Monza Rally Show ganando las ediciones 2006 (en la que compitió contra Colin McRae[27]​) y 2007 junto a Carlo Cassina y consiguió un buen segundo puesto en 2008 así como en el Master Show.

[30]​ Existieron especulaciones sobre la posibilidad de que Rossi dejara el motociclismo para unirse a Ferrari, pero estas fueron desestimadas por el propio piloto.

[35]​ En enero de 2022 fue anunciada su participación a tiempo completo en el GT World Challenge Europe con Team WRT.