Tinción de Gram
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir este; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo.
Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante.
El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo.
Una posible hipótesis del mecanismo de tinción es la siguiente: El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua.
El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar.
En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo.
Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.
Como los microorganismos contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH.
Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.
Si por el contrario, poseen forma de «coma» (o curvados) entonces se los designa vibrios.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración se debe a que la membrana externa de las bacterias gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.
La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea.
Por el contrario, las bacterias gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violeta.
