El pintor, que nunca había visto a la retratada, se basó en un retrato anterior, en el que se representaba a la emperatriz con traje negro, hoy desaparecido, pues ardió en el incendio del Palacio del Pardo de 1604.

[2]​ Se ha averiguado que Tiziano reutilizó un lienzo ya pintado para su retrato de Isabel, pues a través de los análisis por radiografía se ha distinguido una figura femenina.

[3]​ Tiziano pintó en un primer momento a la emperatriz con la nariz un tanto aguileña.

Tiziano se trasladó a Augsburgo en 1548 para retocar el cuadro.

Se adorna, además, con llamativas joyas, como un collar de perlas con un broche al pecho con piedras preciosas del que cuelga otra perla en forma de lágrima, una sortija en la mano derecha, o un joyel rematando su tocado, un rígido peinado muy de moda en la época compuesto por trenzas.