El retablo mayor del Convento de Santa Isabel es una obra realizada entre 1613 y 1614 por Francisco Velázquez, Cristóbal Velázquez, Melchor de Beya y Juan Imberto, siendo modificada en 1621 por Gregorio Fernández.

[1]​: 244  Finalmente María del Pilar López Barrientos hizo públicos en 1941 los contratos de obra que permitieron atribuir la pieza correctamente a Fernández, Francisco Velázquez y Juan Imberto, si bien en la misma también participaron Cristóbal Velázquez y Melchor de Beya.

La labor escultórica, elogiada por Antonio Ponz,[1]​: 244  recayó en el tallista oriundo de Segovia Juan Imberto, quien antes de su traslado permanente a su ciudad natal tenía un taller en la calle Juan Mambrilla (entonces calle Francos).

La decimoctava cláusula pone de manifiesto que todas las encarnaciones debían ser mate, «que parezca carne natural dando a cada figura el sentido, unas mas hermosas que otras conforme combiene», señalando la decimonovena que los rostros y los cuerpos desnudos tenían que ser encarnados dos veces, la primera a pulimento y la segunda mate «q imite al natural y todas las orillas de las figuras así redondas como de las Historias sean hechos a punta de pincel conforme el ancho q convenga para q parezca mejor».

También se indica en esta misma cláusula que Martínez quedaba obligado a realizar toda la policromía del retablo y a tenerla acabada en un plazo de diez meses «y asentado estofando también la Imagen de nra.

Por último, en la vigesimocuarta cláusula queda reflejado que debía ser Martínez el único en policromar el retablo sin posibilidad de delegar la labor en otra persona a menos que fuese de manera puntual.

San Juan Bautista resulta reconocible por vestir piel de camello, tener un Agnus Dei a sus pies sobre un libro y portar en la mano izquierda una caña con forma de cruz, mientras que San Antonio está acompañado por el Niño Jesús sentado en un libro que sostiene con la mano izquierda (tipología que empezó a ponerse de moda en la época), identificándose Prudencia por sostener un espejo con la mano izquierda y tener una serpiente enroscada en su brazo derecho y Justicia por lucir una espada y una balanza.

Por su parte, San Juan Evangelista se identifica por portar una copa envenenada con la mano izquierda y tener un águila a los pies, mientras que a San Bernardino se le distingue por vestir hábito franciscano, sujetar una palma con la mano derecha, un libro con la izquierda y, sobre todo, por hallarse a sus pies tres mitras como símbolo de su renuncia a las sedes episcopales de Siena, Urbino y Ferrara, si bien carece de uno de sus atributos más conocidos: un disco llameante con el monograma IHS.

[6]​: 272–273 En cuanto al ático (cuya cornisa no se corresponde con la plasmada en el contrato), en él se cobija, bajo un arco carpanel coronado por un frontón triangular, un Calvario sobre un fondo en el que se representa la ciudad de Jerusalén entre sombras;[1]​: 246  de bulto redondo y estilo romanista (probablemente de finales del siglo xvi), la imagen del crucificado destaca por poseer unas dimensiones notablemente superiores a las figuras de la Dolorosa y San Juan, ubicándose a los lados San Buenaventura a la derecha y San Luis de Francia a la izquierda (pese a que en la traza del retablo figuran los santos franciscanos Luis, Bernardino, Buenaventura y Antonio en el ático, ya en las cláusulas del contrato de la policromía consta una ubicación diferente).

En actitud de arrepentimiento, la Magdalena exhibe su melena suelta mientras sujeta una cruz, si bien luce todavía lujosas prendas de cortesana, figurando en el suelo un frasco con perfumes, mientras que San Jerónimo, muy similar a la Magdalena, aparece desnudo de cintura para arriba sujetando con una mano una cruz al tiempo que con la otra se golpea el pecho, destacando a sus pies un león y, colgado en un árbol, el capelo cardenalicio.

[2]​[5]​ Fernández consolidó con estas imágenes, de gran espiritualidad y con una marcada composición diagonal, dos prototipos: primero con la imagen del pobre, en la cual recicla una tipología empleada con anterioridad por él mismo, y segundo con la representación de Santa Isabel, en la que introduce una iconografía que terminaría por convertirse en su marca personal en lo que a representaciones de santas se refiere.

A la figura de la santa hay que añadir las carnaciones mate y la rica cenefa dorada de los ropajes, con motivos que simulan pedrería, esto último exigido en el contrato.

[5]​ Ubicada en el lado del evangelio, la imagen de San Miguel, de bulto redondo, posee un tamaño cercano al natural y muestra al arcángel erguido y victorioso sobre Lucifer, quien aparece derrotado a sus pies.

Con una disposición idéntica a la imagen de Fernández (el brazo izquierdo bajado y portando en origen un escudo ya desaparecido en base a la posición de los dedos, el derecho levantado al tiempo que sostiene una lanza y la pierna izquierda flexionada y apoyada sobre Lucifer), la pierna derecha, en vez de estar situada detrás del ángel caído, se halla frente a él, lo que dota al conjunto de mayor rotundidad.

Destacan otras variantes que ayudan a remarcar la diferencia entre ambas esculturas, como la disposición de la figura demoníaca en sentido opuesto, con la cabeza hacia la derecha (lo que obliga a que el arcángel gire la suya hacia el mismo lado), y las alas extendidas en vez de replegadas como el modelo fernandino.

La imagen del infante, de gran expresividad, es sin embargo muy limitada a nivel plástico.

En lo tocante a la policromía, se aprecian tonalidades en verde y marfil que contrastan notablemente con la intensidad de los rojos ornamentales.

[7]​ El retablo posee una importante influencia del artista Hieronymus Wierix, concretamente los relieves de la Anunciación y la Resurrección y tal vez el grupo Santa Isabel y el Pobre, con las dos primeras piezas basadas con seguridad en grabados realizados por Wierix los cuales circulaban por Europa a principios del siglo xvii.

Esta escena evangélica presenta un esquema más o menos rígido el cual permite muy pocas variantes: por lo general solo figuran dos o como mucho tres y hasta cuatro personajes (el arcángel Gabriel, la Virgen, el Espíritu Santo y Dios Padre); la escena suele transcurrir en un entorno cerrado o semicerrado (generalmente un dormitorio); la Virgen acostumbra a figurar de rodillas en actitud de sumisión interrumpiendo la lectura de las Sagradas Escrituras; y como adornos habitualmente aparecen un reclinatorio y un jarrón con lirios, esto último como símbolo de la pureza virginal de María.

Este grabado cuenta con la firma del autor en la esquina inferior derecha («Hieronymus Wierix ex.») y exhibe una pequeña cartela en la zona inferior con la leyenda «Gabriel Angelus locutus est Maria, dixens: Ave gratia plena.

La cama empleada por Wierix suele tener un dosel cónico con las cortinas cayendo delicadamente a modo de cierre de la composición en el fondo (destaca en este caso la escena mostrada en la edición del Evangelicae Historiae correspondiente a 1593, en cuya parte alta figura el monograma IHS).

El momento reflejado posee múltiples semejanzas con la Anunciación (misma cama, la Virgen sorprendida arrodillada frente a un reclinatorio e interrumpiendo la lectura, etc.), aunque en comparación con el grabado pueden apreciarse elementos diferenciadores tales como la ausencia del reclinatorio y de nubes bajo la imagen del resucitado.

Respecto a Santa Isabel, en ambos casos se recoge un extremo del manto bajo la mano izquierda, en la que figura un libro (con una corona en la talla y dos en el grabado).