La serie es protagonizada por las Tortugas Ninja basadas en el cómic de Kevin Eastman y Peter Laird.
El tono oscuro del cómic fue cambiado considerablemente en la serie para ser más adecuado a la familia.
Cuando la serie continuó con una segunda temporada, el artista del cómic Jack Mendelsohn se unió como editor ejecutivo de la trama.
En 1990, la serie era transmitida diariamente en más de 125 transmisoras televisivas, y los cómics vendían 125.000 copias por mes.
En esta versión, Splinter era un ser humano, un honorable maestro ninja llamado Hamato Yoshi.
Yoshi fue expulsado del Foot Clan en Japón después de ser engañado por Oroku Saki, quien colgó el keikogi de Yoshi contra la pared con un cuchillo, impidiéndole arrodillarse frente al sensei, lo que fue visto como un insulto.
La sustancia resultó ser un potente mutágeno que transformaba a quienes se exponían a ella otorgándole tributos de algún organismo con que hubiera tenido contacto repetitivo.
Yoshi adopta a las cuatro tortugas como sus hijos y los entrena en el arte del ninjitsu.
Les da nombres inspirados en sus artistas favoritos del renacimiento italiano: Leonardo da Vinci (Leonardo), Donato di Niccolò di Betto Bardi (Donatello), Raffaello Sanzio (Raphael) y Michelangelo Buonarroti (Michelangelo).
Cada tortuga ninja usa una antifaz sobre sus ojos con un color distintivo y cada una está entrenada en el uso de un arma.