Isabel era la mayor de los quince hijos del emperador Fernando I de Habsburgo y de Ana Jagellón de Hungría y Bohemia.

El 5 de mayo de 1543 se casó con Segismundo II Augusto Jagellón, gran duque de Lituania y heredero del trono de Polonia.

Sin embargo, Isabel murió muy joven, sin dar un heredero al trono, y fue enterrada en la Catedral de Vilna.

Segismundo se casó dos veces más; primero con Bárbara Radziwiłł, y después con la hermana de Isabel, Catalina de Habsburgo, pero no tuvo hijos de ninguno de sus tres matrimonios.

Sobre su muerte, hubo rumores de envenenamiento acusando a su suegra, la reina de Polonia Bona Sforza, enemiga de los Habsburgo.