Se educó en Wayne (Pensilvania) y posteriormente estudió en la American Academy of Dramatic Arts de Nueva York.

Nance O'Neil encabezaba un reparto que incluía a Gloria Holden, Alan Bunce, y Claire Carleton.

Esta obra en technicolor, que contó con John Litel como actor principal masculino, fue candidata a un Oscar.

En Tras el sol naciente (Behind the Rising Sun, 1943), basada en los hechos de Pearl Harbor, Gloria Holden se encargaba del personaje de Sara Braden, y trabajaba junto a Robert Ryan y Margo, dirigidos por Edward Dmytryk.

Gloria Holden trabajó en múltiples producciones a lo largo de los años cuarenta y cincuenta; algunas son The Hucksters, 1947, dirigida por Jack Conway), Killer McCoy (1947), Precious Waters (1948), A Kiss for Corliss (1949, dirigida por Richard Wallace), y Eddie Duchin (The Eddie Duchin Story, 1956).