Espectroscopia de fluorescencia

Las colisiones con otras moléculas causan a la molécula excitada la pérdida de energía vibratoria hasta que alcanza el menor estado vibratorio del estado electrónico excitado.Para especies atómicas, el proceso es similar, sin embargo desde especies atómicas no se poseen niveles vibratorios de energía, los fotones emitidos están con frecuencia con la misma longitud de onda que la radiación incidente.Un monocromador transmite luz con longitud de onda ajustable con su respectiva tolerancia.El monocromador puede ser ajustado seleccionando la longitud de onda a transmitir.En oposición a la espectroscopia UV / visible ‘estándar’, los espectros indistintamente del dispositivo, no son fáciles de conseguir.Además, la no lámpara tiene una intensidad constante en todas las longitudes de onda.Dos otros temas que deben ser considerados incluyen la óptica utilizada para controlar la radiación y los medios de retener o contener el material de la muestra (llamada cubeta o celda).La corrección de todos estos factores instrumentales para obtener un espectro ‘estándar’ es un proceso tedioso, el cual solamente es aplicado en práctica cuando es estrictamente necesario.Otros aspectos de tener en cuenta son los efectos internos del filtro.Si este es el caso, algunos o todos los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos de nuevo.Otro efecto interno del filtro ocurre debido a concentraciones elevadas de moléculas absorbentes, incluyendo el fluoróforo.El resultado es que la intensidad de la luz excitada no es constante en toda la solución.[8]​ Además, el triptófano fluorescente es fuertemente influenciado por la cercanía de otros residuos (es decir, cercanos grupos protonados tales como Asp o Glu puede causar Quenching (fluorescencia) de Trp fluorencente).También, es posible la energía de trasferencia entre el triptófano y otros aminoácidos fluorescentes, lo que afectaría el análisis, especialmente, en casos donde el ácido Förster es tomado.En adición, el triptófano es un raro aminoácido; muchas proteínas contienen solo uno o varios residuos de tirptófano.La ventaja en comparación con las sondas extrínsecas es que la propia proteína no cambia.Cuando se realizan los experimentos con desnaturalizantes, tensoactivo u otra molécula anfifílica, el microambiente del triptófano podría cambiar.Por ejemplo, si una proteína contiene un solo triptófano en su núcleo “hidrofóbico” se desnaturaliza con el incremento de temperatura, un desplazamiento en el espectro causaría que la emisión del rojo desapareciera.En contraste, la adición de un tensiactivo a una proteína que contiene un triptófano el cual está expuesto al disolvente acuoso podría causar un desplazamiento en la emisión del espectro azul, si el triptófano está incrustado en el tensioactivo vesícula o micela.[9]​ Las proteínas que carecen del triptófano pueden ser acopladas a un fluoróforo.Su uso también ha sido reportado en la diferenciación de tumores malignos y benignos en la piel.