Es más conocido por ser hijo de Hans Holbein el Viejo y hermano de Hans Holbein el Joven, ya que su producción propia es pequeña debido a su prematura muerte.Tanto él como su hermano nacieron en Augsburgo, entonces ciudad libre del Sacro Imperio y uno de los más importantes centros culturales y comerciales de la región.Esto era normal para un artista de su época, que debía dominar diversas técnicas y habilidades.Los dos hermanos Holbein se trasladaron en 1516 a Basilea, donde Ambrosius trabajaba en el estudio de Hans Herbster.En 1517 se inscribió en el Gremio de Pintores de Basilea y, al año siguiente, recibió la ciudadanía.
