El Northern blot , o transferencia de ARN, [1] es una técnica utilizada en la investigación de biología molecular para estudiar la expresión genética mediante la detección de ARN (o ARNm aislado ) en una muestra. [2] [3]
Con el Northern blotting es posible observar el control celular sobre la estructura y función al determinar las tasas particulares de expresión génica durante la diferenciación y la morfogénesis , así como en condiciones anormales o patológicas. [4] El Northern blotting implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y la detección con una sonda de hibridación complementaria a parte o la totalidad de la secuencia diana. Estrictamente hablando, el término 'Northern blot' se refiere específicamente a la transferencia capilar de ARN desde el gel de electroforesis a la membrana de transferencia. Sin embargo, el proceso completo se conoce comúnmente como Northern blotting. [5] La técnica Northern blot fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford . [6] El Northern blotting toma su nombre de su similitud con la primera técnica de transferencia, el Southern blot , llamado así por el biólogo Edwin Southern . [2] La principal diferencia es que en el Northern blot se analiza ARN, en lugar de ADN . [7]
Un procedimiento general de transferencia [5] comienza con la extracción de ARN total de una muestra de tejido homogeneizado o de células. El ARNm eucariota puede luego aislarse mediante el uso de cromatografía de oligo (dT) celulosa para aislar solo aquellos ARN con una cola de poli(A) . [8] [9] Las muestras de ARN luego se separan mediante electroforesis en gel. Dado que los geles son frágiles y las sondas no pueden ingresar a la matriz, las muestras de ARN, ahora separadas por tamaño, se transfieren a una membrana de nailon a través de un sistema de transferencia capilar o al vacío.
Una membrana de nailon con carga positiva es la más eficaz para su uso en el Northern blotting, ya que los ácidos nucleicos cargados negativamente tienen una alta afinidad por ellos. El tampón de transferencia utilizado para el blotting normalmente contiene formamida porque reduce la temperatura de hibridación de la interacción sonda-ARN, eliminando así la necesidad de altas temperaturas, que podrían causar la degradación del ARN. [10] Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza a través de un enlace covalente a la membrana mediante luz ultravioleta o calor. Después de que una sonda se ha marcado, se hibrida con el ARN en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación incluyen la fuerza iónica, la viscosidad, la longitud del dúplex, los pares de bases no coincidentes y la composición de bases. [11] La membrana se lava para garantizar que la sonda se haya unido específicamente y para evitar que surjan señales de fondo. Las señales híbridas se detectan luego mediante una película de rayos X y se pueden cuantificar mediante densitometría . Para crear controles para la comparación en un Northern blot, se pueden utilizar muestras que no muestren el producto genético de interés después de la determinación mediante microarrays o RT-PCR . [11]
Las muestras de ARN se separan más comúnmente en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del ARN para limitar la estructura secundaria. [11] [12] Los geles se pueden teñir con bromuro de etidio (EtBr) y observar bajo luz ultravioleta para observar la calidad y cantidad de ARN antes de transferirlos. [11] La electroforesis en gel de poliacrilamida con urea también se puede utilizar en la separación de ARN, pero se utiliza más comúnmente para ARN fragmentado o microARN. [13] A menudo se ejecuta una escalera de ARN junto con las muestras en un gel de electroforesis para observar el tamaño de los fragmentos obtenidos, pero en las muestras de ARN total, las subunidades ribosómicas pueden actuar como marcadores de tamaño. [11] Dado que la subunidad ribosómica grande es 28S (aproximadamente 5 kb) y la subunidad ribosómica pequeña es 18S (aproximadamente 2 kb), aparecen dos bandas prominentes en el gel, la más grande con casi el doble de intensidad que la más pequeña. [11] [14]
Las sondas para el Northern blot se componen de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del ARN de interés. Pueden ser ADN, ARN u oligonucleótidos con un mínimo de 25 bases complementarias a la secuencia diana. [5] Las sondas de ARN (ribosondas) que se transcriben in vitro pueden soportar pasos de lavado más rigurosos, lo que evita parte del ruido de fondo. [11] Comúnmente, el ADNc se crea con cebadores marcados para la secuencia de ARN de interés para que actúe como sonda en el Northern blot. [15] Las sondas deben estar marcadas con isótopos radiactivos ( 32P ) o con quimioluminiscencia en la que la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante (HRP) descomponen los sustratos quimioluminiscentes produciendo una emisión detectable de luz. [16] El marcaje quimioluminiscente puede ocurrir de dos maneras: o bien la sonda se une a la enzima, o bien la sonda se marca con un ligando (por ejemplo, biotina ) para el cual el ligando (por ejemplo, avidina o estreptavidina ) se une a la enzima (por ejemplo, HRP). [11] La película de rayos X puede detectar tanto las señales radiactivas como las quimioluminiscentes y muchos investigadores prefieren las señales quimioluminiscentes porque son más rápidas, más sensibles y reducen los riesgos para la salud que acompañan a las etiquetas radiactivas. [16] La misma membrana se puede sondear hasta cinco veces sin una pérdida significativa del ARN diana. [10]
El Northern blotting permite observar el patrón de expresión de un gen particular entre tejidos, órganos, etapas de desarrollo, niveles de estrés ambiental, infección por patógenos y durante el curso del tratamiento. [9] [15] [17] La técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la regulación negativa de genes supresores de tumores en células cancerosas en comparación con el tejido "normal", [11] así como la expresión génica en el rechazo de órganos trasplantados. [18] Si se observa un gen sobreexpresado por una abundancia de ARNm en el Northern blot, la muestra puede secuenciarse para determinar si los investigadores conocen el gen o si es un hallazgo novedoso. [18] Los patrones de expresión obtenidos en determinadas condiciones pueden proporcionar información sobre la función de ese gen. Dado que el ARN se separa primero por tamaño, si solo se utiliza un tipo de sonda, la variación en el nivel de cada banda en la membrana puede proporcionar información sobre el tamaño del producto, lo que sugiere productos de empalme alternativos del mismo gen o motivos de secuencia repetitivos. [8] [14] La variación en el tamaño de un producto génico también puede indicar deleciones o errores en el procesamiento de la transcripción. Al alterar la sonda diana utilizada a lo largo de la secuencia conocida, es posible determinar qué región del ARN falta. [2]
El análisis de la expresión génica se puede realizar mediante varios métodos diferentes, incluidos RT-PCR, ensayos de protección de ARNasa, microarrays, RNA-Seq , análisis en serie de la expresión génica (SAGE), así como transferencia Northern. [4] [5] Los microarrays se utilizan con bastante frecuencia y suelen ser consistentes con los datos obtenidos a partir de transferencias Northern; sin embargo, a veces la transferencia Northern puede detectar pequeños cambios en la expresión génica que las microarrays no pueden. [19] La ventaja que tienen las microarrays sobre las transferencias Northern es que se pueden visualizar miles de genes a la vez, mientras que la transferencia Northern suele observar uno o un pequeño número de genes. [17] [19]
Un problema en el Northern blot es a menudo la degradación de la muestra por las ARNasas (tanto endógenas a la muestra como a través de la contaminación ambiental), que se puede evitar mediante la esterilización adecuada del material de vidrio y el uso de inhibidores de ARNasa como DEPC ( dietilpirocarbonato ). [5] Los productos químicos utilizados en la mayoría de los Northern blots pueden ser un riesgo para el investigador, ya que el formaldehído, el material radiactivo, el bromuro de etidio, el DEPC y la luz ultravioleta son dañinos bajo ciertas exposiciones. [11] En comparación con la RT-PCR, el Northern blot tiene una baja sensibilidad, pero también tiene una alta especificidad, lo que es importante para reducir los resultados falsos positivos. [11]
Las ventajas de utilizar la técnica Northern blotting incluyen la detección del tamaño del ARN, la observación de productos de empalme alternativos, el uso de sondas con homología parcial, la calidad y cantidad del ARN se puede medir en el gel antes del blotting y las membranas se pueden almacenar y volver a analizar durante años después del blotting. [11]
Para la transferencia Northern para la detección del ARNm de la acetilcolinesterasa , se comparó la técnica no radiactiva con una radiactiva y se encontró que era tan sensible como la radiactiva, pero no requiere protección contra la radiación y consume menos tiempo. [20]
Los investigadores utilizan ocasionalmente una variante del procedimiento conocida como transferencia Northern inversa. En este procedimiento, el ácido nucleico del sustrato (que se fija a la membrana) es una colección de fragmentos de ADN aislados, y la sonda es ARN extraído de un tejido y marcado radiactivamente. El uso de microarrays de ADN que se han generalizado a fines de la década de 1990 y principios de la década de 2000 es más similar al procedimiento inverso, ya que implica el uso de fragmentos de ADN aislados fijados a un sustrato y la hibridación con una sonda hecha de ARN celular. Por lo tanto, el procedimiento inverso, aunque originalmente poco común, permitió que el análisis Northern evolucionara hacia el perfil de expresión génica , en el que se puede monitorear la expresión de muchos (posiblemente todos) los genes de un organismo.
