La síntesis de proteínas sin células , también conocida como síntesis de proteínas in vitro o CFPS , es la producción de proteínas utilizando maquinaria biológica en un sistema sin células , es decir, sin el uso de células vivas . El entorno de síntesis de proteínas in vitro no está limitado por una pared celular o las condiciones de homeostasis necesarias para mantener la viabilidad celular. [1] Por lo tanto, CFPS permite el acceso directo y el control del entorno de traducción , lo que es ventajoso para una serie de aplicaciones, incluida la solubilización co-traduccional de proteínas de membrana, la optimización de la producción de proteínas, la incorporación de aminoácidos no naturales, el etiquetado selectivo y específico del sitio. [2] [3] Debido a la naturaleza abierta del sistema, se pueden examinar diferentes condiciones de expresión como pH, potenciales redox , temperaturas y chaperonas . Dado que no es necesario mantener la viabilidad celular, se pueden producir proteínas tóxicas.
Los componentes comunes de una reacción acelular incluyen un extracto celular, una fuente de energía, un suministro de aminoácidos , cofactores como el magnesio y el ADN con los genes deseados . Un extracto celular se obtiene lisando la célula de interés y centrifugando las paredes celulares, el genoma del ADN y otros desechos. Los restos son la maquinaria celular necesaria, incluidos los ribosomas , las aminoacil-ARNt sintetasas , los factores de iniciación y elongación de la traducción , las nucleasas , etc.
Se pueden utilizar dos tipos de ADN en CFPS: plásmidos y plantillas de expresión lineal (LET). Los plásmidos son circulares y solo se crean dentro de las células. Las LET se pueden crear de forma mucho más eficaz mediante PCR , que replica el ADN mucho más rápido que criando células en una incubadora . Si bien las LET son más fáciles y rápidas de crear, los rendimientos de plásmidos suelen ser mucho mayores en CFPS. Debido a esto, gran parte de la investigación actual se centra en optimizar los rendimientos de LET de CFPS para acercarse a los rendimientos de CFPS con plásmidos.
Una fuente de energía es una parte importante de una reacción sin células. Por lo general, se añade al extracto una mezcla separada que contiene la fuente de energía necesaria, junto con un suministro de aminoácidos, para la reacción. Las fuentes comunes son el fosfoenolpiruvato , el acetilfosfato y el fosfato de creatina .
La CFPS tiene muchas ventajas sobre la síntesis tradicional in vivo de proteínas. En particular, una reacción sin células, incluida la preparación del extracto, suele tardar entre 1 y 2 días, mientras que la expresión de proteínas in vivo puede tardar entre 1 y 2 semanas. [4] [5] [6] [7]
La CFPS es una reacción abierta. La falta de pared celular permite la manipulación directa del entorno químico. Las muestras se toman fácilmente, las concentraciones se optimizan y la reacción se puede monitorear. Por el contrario, una vez que el ADN se inserta en células vivas, no se puede acceder a la reacción hasta que finaliza y las células se lisan.
Otra ventaja de la CFPS es que no hay que preocuparse por la toxicidad. Algunas proteínas deseadas y proteínas marcadas son tóxicas para las células cuando se sintetizan. [8] Como no se utilizan células vivas, la toxicidad de la proteína del producto no es una preocupación importante.
Estas ventajas permiten numerosas aplicaciones. [9] [1] Una de las principales aplicaciones del CFPS es la incorporación de aminoácidos no naturales en las estructuras proteínicas (véase el código genético ampliado ). La apertura de la reacción es ideal para insertar los ARNt modificados y los aminoácidos no naturales necesarios para dicha reacción.
La biología sintética tiene muchos otros usos y es un futuro brillante en campos como la evolución de proteínas , las nanomáquinas , los circuitos de ácidos nucleicos y la síntesis de partículas similares a virus para vacunas y terapias farmacológicas . [10] [11] [12]
Un desafío asociado con CFPS es la degradación del ADN por nucleasas endógenas en el extracto celular. Esto es particularmente problemático con las LET. Las células tienen endonucleasas que atacan sitios aleatorios de una cadena de ADN; sin embargo, mucho más comunes son las exonucleasas que atacan el ADN desde los extremos. Dado que los plásmidos son circulares y no tienen un extremo al que las exonucleasas puedan unirse, no se ven afectados por estas últimas. Sin embargo, las LET son susceptibles a ambos. Debido a la vulnerabilidad de las LET, gran parte de la investigación actual se centra en optimizar los rendimientos de las LET de CFPS para acercarse a los rendimientos de CFPS utilizando plásmidos.
Un ejemplo de esta protección mejorada con plásmidos es el uso de la proteína gam del bacteriófago lambda . [13] Gam es un inhibidor de RecBCD , una exonucleasa que se encuentra en Escherichia coli ( E. coli ). [14] Con el uso de gam, los rendimientos de CFPS con LET aumentaron considerablemente y fueron comparables a los rendimientos de CFPS con plásmidos. [15] También se pueden hacer extractos PUROS, eliminando la preocupación de las exonucleasas. Estos extractos son costosos de hacer y actualmente no son una solución económica al problema de la degradación del ADN exógeno.
Los extractos celulares comunes que se utilizan hoy en día provienen de E. coli (ECE), reticulocitos de conejo (RRL), germen de trigo (WGE), células de insectos (ICE) y levadura Kluyveromyces (el sistema D2P). [1] [5] Todos estos extractos están disponibles comercialmente.
El ECE es el lisado más popular por varias razones. Es el extracto más económico y el que requiere menos tiempo para crearse. Además, se pueden cultivar fácilmente grandes cantidades de E. coli y luego lisarlas fácilmente mediante el uso de un homogeneizador o un sonicador . [1] El ECE también proporciona los rendimientos proteicos más altos. Sin embargo, la producción de alto rendimiento puede limitar la complejidad de la proteína sintetizada, particularmente en la modificación postraduccional . En ese sentido, los sistemas eucariotas de menor eficiencia podrían ser ventajosos, siempre que se hayan mantenido sistemas enzimáticos modificadores en los extractos.
Cada sistema eucariota tiene sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, el extracto WGE produce los mayores rendimientos de los tres extractos eucariotas; sin embargo, no es tan eficaz para algunas modificaciones postraduccionales como la glicosilación . [5] Al elegir un extracto, se deben tener en cuenta el tipo de modificación postraduccional, los rendimientos deseados y el costo.
La síntesis de proteínas acelulares se ha utilizado durante más de 60 años y, en particular, la primera elucidación de un codón fue realizada por Marshall Nirenberg y Heinrich J. Matthaei en 1961 en los Institutos Nacionales de Salud. [1] [16] Utilizaron un sistema acelular para traducir una secuencia de ARN poliuracilo (o UUUUU... en términos bioquímicos ) y descubrieron que el polipéptido que habían sintetizado consistía únicamente en el aminoácido fenilalanina . De este modo, dedujeron a partir de esta polifenilalanina que el codón UUU especificaba el aminoácido fenilalanina. Ampliando este trabajo, Nirenberg y sus colaboradores pudieron determinar la composición de nucleótidos de cada codón.
