Respirometría

Estimación de tasas metabólicas mediante la medición de la producción de calor

La respirometría es un término general que abarca una serie de técnicas para obtener estimaciones de las tasas de metabolismo de vertebrados , invertebrados , plantas , tejidos, células o microorganismos a través de una medida indirecta de la producción de calor ( calorimetría ).

Tasas metabólicas de animales enteros

El metabolismo de un animal se estima determinando las tasas de producción de dióxido de carbono ( _VCO2 ) y el consumo de oxígeno (VO2 ₎ de animales individuales, ya sea en un sistema de respirometría de circuito cerrado o abierto. Normalmente se obtienen dos medidas: tasa metabólica estándar (SMR) o basal (BMR) y tasa máxima ( VO2max ). La SMR se mide mientras el animal está en reposo (pero no dormido) en condiciones específicas de laboratorio (temperatura, hidratación) y específicas del sujeto (p. ej., tamaño o alometría ^[1] ), edad, estado reproductivo, posabsorción para evitar el efecto térmico de los alimentos ). ^[2] _El VO2max se determina típicamente durante el ejercicio aeróbico en o cerca de los límites fisiológicos. ^[3] Por el contrario, la tasa metabólica de campo (FMR) se refiere a la tasa metabólica de un animal activo sin restricciones en la naturaleza. ^[4] Las tasas metabólicas de todo el animal se refieren a estas medidas sin corrección por masa corporal. Si los valores de SMR o BMR se dividen por el valor de masa corporal del animal, entonces la tasa se denomina específica de masa. Es este valor específico de masa el que normalmente se escucha en las comparaciones entre especies. ^[5]

Respirometría cerrada

La respirometría depende del principio de que "lo que entra debe salir". ^[6] Consideremos primero un sistema cerrado. Imaginemos que colocamos un ratón en un recipiente hermético. El aire sellado en el recipiente contiene inicialmente la misma composición y proporciones de gases que estaban presentes en la habitación: 20,95% de O 2 , 0,04% de CO ₂ , vapor de agua (la cantidad exacta depende de la temperatura del aire, véase punto de rocío ), 78% (aproximadamente) de N ₂ , 0,93% de argón y una variedad de gases traza que componen el resto (véase atmósfera terrestre ). A medida que pasa el tiempo, el ratón en la cámara produce CO ₂ y vapor de agua, pero extrae O ₂ del aire en proporción a sus demandas metabólicas. Por lo tanto, siempre que conozcamos el volumen del sistema, la diferencia entre las concentraciones de O ₂ y CO ₂ al inicio, cuando sellamos al ratón en la cámara (las condiciones de referencia) en comparación con las cantidades presentes después de que el ratón haya respirado el aire en un momento posterior, deben ser las cantidades de CO ₂ /O ₂ producidas/consumidas por el ratón . El nitrógeno y el argón son gases inertes y, por lo tanto, sus cantidades fraccionarias no se modifican con la respiración del ratón. En un sistema cerrado, el entorno eventualmente se volverá hipóxico .

Respirometría abierta

Para un sistema abierto, las restricciones de diseño incluyen las características de lavado de la cámara del animal y la sensibilidad de los analizadores de gas. ^{[7] [8]} Sin embargo, el principio básico sigue siendo el mismo: lo que entra debe salir. La principal distinción entre un sistema abierto y cerrado es que el sistema abierto hace fluir aire a través de la cámara (es decir, el aire es empujado o tirado por una bomba) a una velocidad que repone constantemente el O2 _agotado por el animal mientras elimina el CO2 _y el vapor de agua producidos por el animal. La velocidad de flujo volumétrico debe ser lo suficientemente alta para garantizar que el animal nunca consuma todo el oxígeno presente en la cámara mientras que, al mismo tiempo, la velocidad debe ser lo suficientemente baja para que el animal consuma suficiente O2 _{para la detección. Para un} ratón de 20 g , las velocidades de flujo de aproximadamente 200 ml/min a través de contenedores de 500 ml proporcionarían un buen equilibrio. A esta velocidad de flujo, se llevan aproximadamente 40 ml de O2 _a la cámara y todo el volumen de aire en la cámara se intercambia en 5 minutos. Para otros animales más pequeños, los volúmenes de las cámaras pueden ser mucho menores y los caudales también se ajustarían a la baja. Tenga en cuenta que para los animales de sangre caliente o endotérmicos ( aves y mamíferos ), los tamaños de las cámaras y los caudales se seleccionarían para adaptarse a sus tasas metabólicas más altas.

Cálculos

Para calcular las tasas de VO2 _y /o VCO2 _es necesario conocer las tasas de flujo que entran y salen de la cámara, además de las concentraciones fraccionarias de las mezclas de gases que entran y salen de la cámara del animal. En general, las tasas metabólicas se calculan a partir de condiciones de estado estable (es decir, se supone que la tasa metabólica del animal es constante ^{[9] [10]} ). Para conocer las tasas de oxígeno consumido, es necesario saber la ubicación del medidor de flujo en relación con la cámara del animal (si está ubicado antes de la cámara, el medidor de flujo está "aguas arriba", si está ubicado después de la cámara, el medidor de flujo está "aguas abajo"), y si hay o no gases reactivos (por ejemplo, CO2 _, agua , metano , ver gas inerte ).

Para un sistema abierto con medidor de flujo ascendente, agua (por ejemplo, sulfato de calcio anhidro ) y CO2 _eliminados antes del analizador de oxígeno , una ecuación adecuada es

${\displaystyle {\ce {VO2={\frac {{\mathit {FR}}\cdot ({\mathit {F}}_{in}O2-{\mathit {F}}_{ex}O2)}{1-{\mathit {F}}_{ex}O2}}}}}$

Para un sistema abierto con medidor de flujo aguas abajo, agua y CO2 _eliminados antes del analizador de oxígeno , una ecuación adecuada es

${\displaystyle {\ce {VO2={\frac {{\mathit {FR}}\cdot ({\mathit {F}}_{in}O2-{\mathit {F}}_{ex}O2)}{1-{\mathit {F}}_{in}O2}}}}}$

dónde

• FR es el caudal volumétrico ajustado a STP (ver Condiciones estándar de temperatura y presión )
• F _en O ₂ es la cantidad fraccional de oxígeno presente en la corriente de aire actual (la línea base o referencia), y
• F _ex O ₂ es la cantidad fraccional de oxígeno presente en la corriente de aire actual (lo que el animal ha consumido en relación con la línea base por unidad de tiempo).

Por ejemplo, los valores de BMR de un ratón de 20 g ( Mus musculus ) podrían ser FR = 200 mL/min, y las lecturas de concentración fraccional de O ₂ de un analizador de oxígeno son F _in O ₂ = 0,2095, F _ex O ₂ = 0,2072. La tasa calculada de consumo de oxígeno es 0,58 mL/min o 35 mL/hora. Suponiendo una entalpía de combustión para O ₂ de 20,1  julios por mililitro, calcularíamos entonces la producción de calor (y por lo tanto el metabolismo) para el ratón como 703,5 J/h.

Equipo de respirometría

En el caso de los sistemas de flujo abierto, la lista de equipos y piezas es larga en comparación con los componentes de un sistema cerrado, pero la principal ventaja del sistema abierto es que permite el registro continuo de la tasa metabólica. El riesgo de hipoxia también es mucho menor en un sistema abierto.

Bombas para flujo de aire

• Bomba de vacío : se necesita una bomba para empujar (es decir, ubicación aguas arriba) o jalar (es decir, ubicación aguas abajo) aire dentro y a través de la cámara del animal y el sistema de flujo continuo de respirometría.
• Bomba de submuestra: para extraer aire a través de los analizadores, se utiliza una bomba pequeña, estable y confiable.

Medidores de caudal y controladores de caudal

• Medidores de flujo de burbujas: Una forma sencilla, pero muy precisa, de medir los caudales consiste en cronometrar el movimiento de las burbujas de la película de jabón hacia arriba en tubos de vidrio entre marcas de volumen conocido. ^[11] El tubo de vidrio está conectado por la parte inferior (para sistemas de empuje) o por la parte superior (para sistemas de tracción) a la corriente de aire. Una pequeña pera de pipeta de goma unida a la base del tubo actúa como depósito y sistema de suministro de las burbujas de jabón. El funcionamiento es sencillo. En primer lugar, humedezca la superficie del vidrio a lo largo del camino que recorren las burbujas (por ejemplo, presione la pera para que el flujo de aire empuje grandes cantidades de jabón hacia arriba en el vidrio) para proporcionar una superficie prácticamente sin fricción. En segundo lugar, apriete la pera para que se produzca una burbuja limpia. Con un cronómetro en la mano, registre el tiempo necesario para que la burbuja viaje entre las marcas del vidrio. Anote el volumen registrado en la marca superior (por ejemplo, 125 = 125 ml), divida el volumen por el tiempo necesario para viajar entre las marcas y el resultado es el caudal (ml/s). Estos instrumentos pueden adquirirse de diversas fuentes, pero también pueden construirse a partir de pipetas volumétricas de vidrio de tamaño apropiado .
• Medidores de flujo acrílicos: En algunas circunstancias de caudales elevados, podemos utilizar medidores de flujo acrílicos sencillos (0–2,5 litros/min) para controlar los caudales a través de las cámaras metabólicas. Los medidores se encuentran aguas arriba de las cámaras metabólicas. Los medidores de flujo son sencillos de utilizar, pero deben calibrarse dos veces al día para su uso en el sistema de respirometría: una vez antes de que comience el registro (¡pero después de que el animal haya sido sellado dentro de la cámara!) y otra vez al final del registro (antes de que el animal sea retirado de la cámara). La calibración debe realizarse con un medidor de flujo de burbuja porque las marcas de calibración en los medidores acrílicos son solo aproximadas. Para una calibración adecuada de los caudales, recuerde que deben registrarse tanto la presión barométrica como la temperatura del aire que fluye a través del medidor de flujo (que suponemos que es igual a la temperatura ambiente).
• Medidores de flujo másico : Las ecuaciones necesarias para calcular las tasas de consumo de oxígeno o la producción de dióxido de carbono suponen que se conocen con exactitud las tasas de flujo que entran y salen de las cámaras. Utilizamos medidores de flujo másico que tienen la ventaja de proporcionar tasas de flujo independientes de la temperatura y la presión del aire. Por lo tanto, se puede considerar que estas tasas de flujo están corregidas a las condiciones estándar (temperatura y presión estándar). Solo medimos y controlamos el flujo en una ubicación, aguas abajo de la cámara. Por lo tanto, debemos suponer que las tasas de entrada y salida son idénticas. Sin embargo, durante la construcción del sistema de respirometría, la tasa de flujo debe medirse en todos los pasos, en todas las conexiones, para verificar la integridad del flujo.
• Válvulas de aguja : Los medidores de flujo másico se pueden comprar con controladores de flujo másico que permiten establecer los caudales. Sin embargo, son caros. La investigación de respirometría a menudo intentará medir más de un animal a la vez, lo que requeriría una cámara por animal y, por lo tanto, un flujo controlado a través de cada cámara. Un método alternativo y más rentable para controlar el flujo sería mediante válvulas de aguja de acero inoxidable o acero al carbono. Las válvulas de aguja más los medidores de flujo másico brindan un medio rentable para lograr los caudales deseados. Las válvulas cuestan aproximadamente $20.

Tubos y cámaras

• Tubos y conexiones: Se pueden utilizar varios tipos de tubos para conectar los componentes del sistema de respirometría a la cámara del animal y desde ella. Se pueden utilizar distintos tipos de tubos flexibles, según las características del sistema. Se pueden utilizar tubos y conectores de acetilo, Bev-A-Line, Kynar, nailon y Tygon en las regiones del sistema donde las atmósferas oxidantes son bajas (por ejemplo, niveles de fondo de ozono únicamente); se recomendarían tubos de teflón si se espera que haya cantidades apreciables de ozono, ya que es inerte al ozono. Los tubos de teflón son más costosos y carecen de flexibilidad.
• Cámaras metabólicas: Las cámaras pueden ser frascos de vidrio con tapones de goma para las tapas; cilindros de jeringas para animales pequeños e insectos; o construidas de plexiglás . Idealmente, las cámaras deben construirse de materiales inertes; por ejemplo, los plásticos acrílicos pueden absorber O ₂ y pueden ser una mala elección para la respirometría con insectos muy pequeños. ^[12] Las cámaras deben construirse de una manera que produzca una mezcla rápida de gases dentro de la cámara. La cámara metabólica más simple para un vertebrado pequeño podría ser un frasco de vidrio con un tapón. Los tapones están equipados con dos puertos: se proporcionan extensiones cortas de tubo de teflón para conexiones de línea. Las extensiones de tubo de teflón se empujan a través del mamparo y la conexión de la línea se termina uniendo una pequeña abrazadera de manguera a la base de la extensión de tubo de teflón. Además, se debe proporcionar una extensión al puerto de entrada dentro del frasco, esto asegura que los gases espiratorios del animal no sean arrastrados por la corriente de flujo entrante. El animal está sellado en el interior y el tapón de goma se mantiene en su lugar con correas de velcro . Si se utiliza un sistema de flujo ascendente, cualquier fuga en la cámara metabólica provocará la pérdida de aire del animal y, por lo tanto, una subestimación de la tasa metabólica del animal. Cuando se encierra a un animal dentro de una cámara metabólica, se debe prestar atención al sello. Para garantizar un sellado hermético antes de cerrar la tapa, introduzca firmemente el tapón en el frasco y asegúrese de que esté parejo. Utilice 1 o 2 correas (es mejor utilizar 2) y tire con fuerza. Se construirán cámaras de acrílico (plexiglás) para algunos usos, pero se necesitará una ingeniería precisa para garantizar un asentamiento adecuado; las juntas ayudarán y el uso juicioso de abrazaderas de ajuste hermético minimizará las fugas.
• Tubos de depuración: se debe eliminar el agua antes y después de la cámara del animal. Una disposición utilizaría una gran columna acrílica de Drierite ( malla 8 (escala) , es decir, relativamente gruesa) aguas arriba (antes de la bomba de empuje, antes de la cámara del animal) para secar la corriente de aire entrante y varios tubos con Drierite de malla más pequeña (10-20, es decir, relativamente fino) para eliminar el agua después de la cámara del animal. Para preparar un tubo de depuración, asegúrese de que haya una pequeña cantidad de algodón en cada extremo del tubo para evitar que las partículas de polvo viajen a los analizadores. Use pequeñas cantidades de algodón, digamos alrededor de 0,005 g, lo suficiente para mantener el polvo fuera del tubo. Grandes cantidades de algodón bloquearán el flujo de aire cuando/si se humedece. Vierta el Drierite en el tubo con un embudo, golpee el tubo en el banco para compactar los granos firmemente (para aumentar el área de superficie; el aire + agua se precipitan a través del Drierite suelto, lo que requiere cambios frecuentes de depuradores) y tápelo con una pequeña cantidad de algodón. Para eliminar el dióxido de carbono] antes y después de la cámara del animal, se utiliza Ascarite II (Ascarite II es una marca registrada de Arthur H. Thomas Co.). Ascarite II contiene NaOH, que es cáustico (así que no entre en contacto con la piel y manténgalo alejado del agua). Se prepara un tubo de fregado colocando una pequeña cantidad de algodón en el extremo del tubo, llenando un tercio del camino con Drierite de malla 10-20, agregando una pequeña cantidad de algodón, luego un tercio adicional del tubo con Ascarite II, otra capa de algodón, seguido de más Drierite y tapando el tubo con otra pequeña cantidad de algodón. Golpee el tubo en el banco a medida que se agrega cada capa para compactar los granos. Nota: Driereite se puede usar una y otra vez (después de calentarlo en un horno), aunque indicar Drierite perderá color con el secado repetido; Ascarite II se usa una vez y se considerará un residuo peligroso .

Analizadores

• Analizador de dióxido de carbono : los analizadores _{de CO2} suelen utilizar métodos de detección basados ​​en infrarrojos para aprovechar el hecho de que el CO2 _absorbe la luz infrarroja y reemite luz en longitudes de onda ligeramente más largas. El medidor de panel del analizador muestra todo el rango de CO2 de 0,01 a 10 % _y también se genera una salida de voltaje proporcional a la concentración de CO2 _para el registro de datos.
• Analizador de oxígeno : Los analizadores de oxígeno adecuados para la respirometría utilizan una variedad de sensores de oxígeno , incluidos sensores galvánicos ("temperatura ambiente"), paramagnéticos , polarográficos ( electrodos de tipo Clark ) y de circonio ("alta temperatura"). Los analizadores galvánicos de O2 _utilizan una celda de combustible que contiene un electrolito ácido , un ánodo de metal pesado y una membrana delgada permeable al gas. Dado que la presión parcial de O2 _cerca del ánodo es cero, el O2 _es impulsado por difusión al ánodo a través de la membrana a una velocidad proporcional a la presión parcial de O2 ambiental _. La celda de combustible produce un voltaje linealmente proporcional a la presión parcial de O2 _en la membrana. Siempre que la temperatura del gabinete sea estable, y siempre que el flujo de aire a través de la celda de combustible sea estable y esté dentro del rango, la respuesta será del 0,01 % o mejor según la electrónica de soporte, el software y otras consideraciones.

Por último, un sistema de adquisición y control de datos informáticos sería una adición típica para completar el sistema. En lugar de un registrador gráfico , se realizan registros continuos del consumo de oxígeno y/o la producción de dióxido de carbono con la ayuda de un convertidor analógico a digital acoplado a una computadora. El software captura, filtra, convierte y muestra la señal según las necesidades del experimentador. Una variedad de empresas e individuos brindan servicio a la comunidad de respirometría (por ejemplo, Sable Systems , Qubit Systems, consulte también Warthog Systems).

Tasas metabólicas mitocondriales

Dentro del cuerpo el oxígeno es entregado a las células y en las células a las mitocondrias , donde es consumido en el proceso generando la mayor parte de la energía requerida por el organismo. La respirometría mitocondrial mide el consumo de oxígeno por las mitocondrias sin involucrar a un animal vivo completo y es la herramienta principal para estudiar la función mitocondrial. ^[13] Tres tipos diferentes de muestras pueden ser sometidas a tales estudios respirométricos: mitocondrias aisladas (de cultivos celulares, animales o plantas); células permeabilizadas (de cultivos celulares); y fibras o tejidos permeabilizados (de animales). En los dos últimos casos la membrana celular se vuelve permeable mediante la adición de sustancias químicas dejando selectivamente intacta la membrana mitocondrial. Por lo tanto, las sustancias químicas que normalmente no podrían atravesar la membrana celular pueden influir directamente en las mitocondrias. Por la permeabilización de la membrana celular, la célula deja de existir como un organismo vivo y definido, dejando solo las mitocondrias como estructuras aún funcionales. A diferencia de la respirometría en animales enteros, la respirometría mitocondrial se realiza en solución, es decir, la muestra se encuentra suspendida en un medio. En la actualidad, la respirometría mitocondrial se realiza principalmente con un método de cámara cerrada.

Sistema de cámara cerrada

La muestra suspendida en un medio adecuado se coloca en una cámara metabólica cerrada herméticamente. Las mitocondrias se llevan a “estados” definidos mediante la adición secuencial de sustratos o inhibidores. Como las mitocondrias consumen oxígeno, la concentración de oxígeno disminuye. Este cambio de concentración de oxígeno se registra mediante un sensor de oxígeno en la cámara. A partir de la tasa de disminución del oxígeno (teniendo en cuenta la corrección por difusión de oxígeno) se puede calcular la frecuencia respiratoria de las mitocondrias. ^[13]

Aplicaciones

Investigación básica

El funcionamiento de las mitocondrias se estudia en el campo de la bioenergética . ^[14] Las diferencias funcionales entre mitocondrias de diferentes especies se estudian mediante respirometría como un aspecto de la fisiología comparativa . ^{[15] [16]}

Investigación aplicada

La respirometría mitocondrial se utiliza para estudiar la funcionalidad mitocondrial en enfermedades mitocondriales o enfermedades con un (sospechoso) fuerte vínculo con las mitocondrias, por ejemplo, diabetes mellitus tipo 2 , ^{[17] [18]} obesidad ^[19] y cáncer . ^[20] Otros campos de aplicación son, por ejemplo, la ciencia del deporte y la conexión entre la función mitocondrial y el envejecimiento . ^[21]

Equipo

El equipo habitual incluye una cámara metabólica sellable, un sensor de oxígeno y dispositivos para registrar datos, agitar, termostatizar y una forma de introducir sustancias químicas en la cámara. Como se ha descrito anteriormente para la respirometría de animales enteros, la elección de los materiales es muy importante. ^[13] Los materiales plásticos no son adecuados para la cámara debido a su capacidad de almacenamiento de oxígeno. Cuando los materiales plásticos son inevitables (por ejemplo, para juntas tóricas, revestimientos de agitadores o tapones), se pueden utilizar polímeros con una permeabilidad al oxígeno muy baja (como PVDF en lugar de, por ejemplo, PTFE ). La difusión de oxígeno restante dentro o fuera de los materiales de la cámara se puede manejar corrigiendo los flujos de oxígeno medidos para el flujo de fondo de oxígeno instrumental. El instrumento completo que comprende los componentes mencionados a menudo se denomina oxígrafo. Las empresas que proporcionan equipos para la respirometría de animales enteros mencionadas anteriormente generalmente no participan en la respirometría mitocondrial. La comunidad recibe servicios a niveles muy variables de precio y sofisticación por parte de empresas como Oroboros Instruments, Hansatech, Respirometer Systems & Applications, YSI Life Sciences o Strathkelvin Instruments.

Véase también

• Tasa metabólica basal
• Calorimetría
• Metabolismo
• Respirómetro
• VO2máx

Referencias

1. White, CR y RS Seymour. 2005. Escala alométrica del metabolismo de los mamíferos. Journal of Experimental Biology 208(9):1611–1619.
2. Blaxter, K. 1989. Metabolismo energético en animales y en el hombre . Cambridge University Press. ISBN  0-521-36931-2
3. Weibel, ER y H. Hoppeler. 2005. La tasa metabólica máxima inducida por el ejercicio varía en función de la capacidad aeróbica muscular. Journal of Experimental Biology 208(9):1635–1644.
4. Nagy, KA 2005. Tasa metabólica de campo y tamaño corporal. Journal of Experimental Biology 208(9):1621–1625.
5. Makarieva, AM, Gorshkov, VG, Li, BL, Chown, SL, Reich, PB y Gavrilov, VM (2008). Las tasas metabólicas específicas de masa media son sorprendentemente similares en los principales dominios de la vida: evidencia del óptimo metabólico de la vida. Actas de la Academia Nacional de Ciencias 105(44):16994-16999.
6. Frappell, PB, HA Blevin y RV Baudinette. 1989. Entender las cámaras de respirometría: lo que entra debe salir. Journal of Theoretical Biology 138(4):479–494. PMID  2593683
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21. Hutter E., Unterluggauer H., Garedew A., Jansen-Durr P. y Gnaiger E. 2006 Respirometría de alta resolución: una herramienta moderna en la investigación sobre el envejecimiento. Exp. Gerontol. 41:103–109.

Enlaces externos

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