El punto de control del huso , también conocido como transición de metafase a anafase , punto de control del ensamblaje del huso ( SAC ), punto de control de la metafase o punto de control mitótico , es un punto de control del ciclo celular durante la metafase de la mitosis o meiosis que impide la separación de los duplicados. cromosomas ( anafase ) hasta que cada cromosoma esté correctamente unido al huso . Para lograr una segregación adecuada, los dos cinetocoros de las cromátidas hermanas deben estar unidos a polos opuestos del huso (orientación bipolar). [1] Sólo este patrón de unión garantizará que cada célula hija reciba una copia del cromosoma. La característica bioquímica definitoria de este punto de control es la estimulación del complejo promotor de la anafase por complejos de ciclina-CDK en fase M , que a su vez provoca la destrucción proteolítica de ciclinas y proteínas que mantienen unidas a las cromátidas hermanas . [2]
El comienzo de la metafase se caracteriza por la conexión de los microtúbulos con los cinetocoros de los cromosomas, así como por la alineación de los cromosomas en el centro de la célula. Cada cromátida tiene su propio cinetocoro y todos los microtúbulos unidos a cinetocoros de cromátidas hermanas irradian desde polos opuestos de la célula. Estos microtúbulos ejercen una fuerza de tracción sobre los cromosomas hacia los extremos opuestos de las células, mientras que la cohesión entre las cromátidas hermanas se opone a esta fuerza.
En la transición de metafase a anafase, esta cohesión entre las cromátidas hermanas se disuelve y las cromátidas separadas son arrastradas hacia lados opuestos de la célula por los microtúbulos del huso. Las cromátidas se separan aún más mediante el movimiento físico de los propios polos del huso. La disociación prematura de las cromátidas puede provocar una segregación errónea de los cromosomas y aneuploidía en las células hijas. Por tanto, la función del punto de control del huso es evitar esta transición a anafase hasta que los cromosomas estén correctamente unidos, antes de que las cromátidas hermanas se separen.
Para preservar la identidad y el correcto funcionamiento de la célula, es necesario mantener el número adecuado de cromosomas después de cada división celular . Un error al generar células hijas con un número menor o mayor de cromosomas de lo esperado (una situación denominada aneuploidía ) puede conducir, en el mejor de los casos, a la muerte celular o, alternativamente, puede generar resultados fenotípicos catastróficos. [3] [4] Los ejemplos incluyen:
Zirkle (en 1970) fue uno de los primeros investigadores en observar que, cuando sólo un cromosoma se retrasa en llegar a la placa metafásica, el inicio de la anafase se pospone hasta algunos minutos después de su llegada. [5] Esta observación, junto con otras similares, sugirió que existe un mecanismo de control en la transición de metafase a anafase. Con el uso de fármacos como el nocodazol y la colchicina , el huso mitótico se desmonta y el ciclo celular se bloquea en la transición de metafase a anafase. Usando estos medicamentos (ver la revisión de Rieder y Palazzo en 1992 [6] ), el supuesto mecanismo de control se denominó Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Este mecanismo regulador ha sido intensamente estudiado desde entonces. [7]
Utilizando diferentes tipos de estudios genéticos, se ha establecido que diversos tipos de defectos son capaces de activar el SAC: la despolimerización del huso, [8] [9] la presencia de cromosomas dicéntricos (con dos centrómeros), [10] centrómeros que se segregan en una de manera aberrante, [11] defectos en los cuerpos polares del huso en S. cerevisiae , [12] defectos en las proteínas cinetocoras, [13] mutaciones en el ADN centromérico [14] o defectos en los motores moleculares activos durante la mitosis. [8] Un resumen de estas observaciones se puede encontrar en el artículo de Hardwick y colaboradores de 1999. [15]
Utilizando sus propias observaciones, Zirkle [5] fue el primero en proponer que "alguna (...) sustancia, necesaria para que la célula pase a la anafase, aparece algunos minutos después del C (momento de la llegada del último cromosoma a la placa metafásica) , o después de un cambio drástico en la condición citoplasmática , justo en C o inmediatamente después de C", lo que sugiere que esta función se localiza en cinetocoros no unidos al huso mitótico. McIntosh amplió esta propuesta, sugiriendo que una enzima sensible a la tensión ubicada en los centrómeros produce un inhibidor del inicio de la anafase cuando los dos cinetocoros hermanos no están bajo tensión bipolar. [16] De hecho, los datos disponibles sugirieron que la señal "esperar para entrar en anafase" se produce principalmente en o cerca de cinetocoros no adheridos. [17] Sin embargo, el evento principal asociado a la unión del cinetocoro al huso, que es capaz de inactivar la señal inhibidora y liberar la detención de la metafase, podría ser la adquisición de microtúbulos por parte del cinetocoro (como propusieron Rieder y colaboradores en 1995 [17] ), o la tensión que estabiliza el anclaje de los microtúbulos a los cinetocoros (como lo sugieren los experimentos realizados en el laboratorio de Nicklas [18] ). Estudios posteriores en células que contienen dos husos mitóticos independientes en un único citoplasma mostraron que el inhibidor de la transición de metafase a anafase es generado por cinetocoros no adheridos y no se difunde libremente en el citoplasma. [19] Sin embargo, en el mismo estudio se demostró que, una vez que la transición de metafase a anafase se inicia en una parte de la célula, esta información se extiende a lo largo de todo el citoplasma y puede superar la señal "esperar a entrar en anafase". asociado a un segundo huso que contiene cinetocoros no adheridos.
Cuando las células están listas para dividirse, porque el tamaño celular es lo suficientemente grande o porque reciben el estímulo apropiado, [20] activan el mecanismo para ingresar al ciclo celular y duplican la mayoría de los orgánulos durante la fase S (síntesis), incluido su centrosoma. . Por tanto, cuando finalice el proceso de división celular, cada célula hija recibirá un conjunto completo de orgánulos. Al mismo tiempo, durante la fase S todas las células deben duplicar su ADN con mucha precisión, un proceso denominado replicación del ADN . Una vez finalizada la replicación del ADN, en los eucariotas la molécula de ADN se compacta y condensa, para formar los cromosomas mitóticos , cada uno constituido por dos cromátidas hermanas , las cuales se mantienen unidas por el establecimiento de cohesión entre ellas; Cada cromátida es una molécula de ADN completa, unida mediante microtúbulos a uno de los dos centrosomas de la célula en división, ubicados en polos opuestos de la célula. La estructura formada por los centrosomas y los microtúbulos se denomina huso mitótico , debido a su forma característica, sujetando los cromosomas entre los dos centrosomas. Las cromátidas hermanas permanecen juntas hasta la anafase , cuando cada una viaja hacia el centrosoma al que está unida. De esta forma, cuando las dos células hijas se separen al final del proceso de división, cada una contendrá un juego completo de cromátidas. El mecanismo responsable de la correcta distribución de las cromátidas hermanas durante la división celular se denomina segregación cromosómica .
Para garantizar que la segregación cromosómica se produzca correctamente, las células han desarrollado un mecanismo preciso y complejo. En primer lugar, las células deben coordinar la duplicación del centrosoma con la replicación del ADN, y un fallo en esta coordinación generará husos mitóticos monopolares o multipolares, que generalmente producirán una segregación cromosómica anormal, [21] porque en este caso no se producirá la distribución cromosómica. de forma equilibrada.
Durante la fase S, el centrosoma comienza a duplicarse. Justo al comienzo de la mitosis, ambos centriolos alcanzan su longitud máxima, reclutan material adicional y aumenta su capacidad para nuclear microtúbulos. A medida que avanza la mitosis, ambos centrosomas se separan para generar el huso mitótico. [22] De esta manera, el huso mitótico tiene dos polos que emanan microtúbulos. Los microtúbulos (MT) son filamentos proteicos largos, con extremidades asimétricas: un extremo denominado extremo "menos" (-), relativamente estable y cercano al centrosoma, y un extremo denominado extremo "más" (+), con fases alternas de crecimiento y retracción, explorando el centro de la célula buscando los cromosomas. Cada cromátida tiene una región especial, denominada centrómero , encima de la cual se ensambla una estructura proteica denominada cinetocoro , que es capaz de estabilizar el extremo positivo del microtúbulo. Por lo tanto, si por casualidad un microtúbulo que explora el centro de la célula encuentra un cinetocoro, puede suceder que el cinetocoro lo capture, de modo que el cromosoma se una al huso a través del cinetocoro de una de sus cromátidas hermanas. El cromosoma juega un papel activo en la unión de los cinetocoros al huso. Unido a la cromatina hay un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) de Ran que estimula el Ran citosólico cerca del cromosoma para que se una a GTP en lugar de GDP. La forma activada de Ran unida a GTP libera proteínas estabilizadoras de microtúbulos, como TPX2, de complejos proteicos en el citosol, lo que induce la nucleación y polimerización de microtúbulos alrededor de los cromosomas. [23] Estos microtúbulos derivados del cinetocoro, junto con las proteínas motoras de cinesina en el cinetocoro externo, facilitan las interacciones con la superficie lateral de un microtúbulo derivado del polo del huso. Sin embargo, estos accesorios laterales son inestables y deben convertirse en accesorios de extremo. La conversión de uniones laterales a terminales permite que el crecimiento y la contracción de los extremos positivos de los microtúbulos se conviertan en fuerzas que empujan y tiran de los cromosomas para lograr una biorientación adecuada. Como sucede que las cromátidas hermanas están unidas y ambos cinetocoros están ubicados espalda con espalda en ambas cromátidas, cuando un cinetocoro se une a un centrosoma, el cinetocoro hermano queda expuesto al centrosoma ubicado en el polo opuesto; por esta razón, en la mayoría de los casos el segundo cinetocoro se asocia al centrosoma en el polo opuesto, a través de sus microtúbulos, [24] de modo que los cromosomas se vuelven "biorientados", una configuración fundamental (también denominada anfitélica ) para asegurar que el cromosoma La segregación se llevará a cabo correctamente cuando la célula se divida. [25] [26]Ocasionalmente, uno de los dos cinetocoros hermanos puede unirse simultáneamente a los MT generados por ambos polos, una configuración denominada merotélica , que no es detectada por el punto de control del huso pero que puede generar cromosomas retrasados durante la anafase y, en consecuencia, aneuploidía. La orientación merotélica (caracterizada por la ausencia de tensión entre cinetocoros hermanos) es frecuente al inicio de la mitosis, pero la proteína Aurora B (una quinasa conservada desde levaduras hasta vertebrados) detecta y elimina este tipo de anclaje. [27] (Nota: Aurora B se sobreexpresa con frecuencia en varios tipos de tumores y actualmente es un objetivo para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. [28] )
Como se ha señalado anteriormente, las cromátidas hermanas permanecen asociadas desde la fase S (cuando el ADN se replica para generar dos copias idénticas, las dos cromátidas) hasta la anafase. En este punto, las dos cromátidas hermanas se separan y viajan a polos opuestos en la célula en división. Los estudios genéticos y bioquímicos en levaduras y extractos de huevos de Xenopus laevis identificaron un complejo poliproteico como un actor esencial en la cohesión de las cromátidas hermanas (ver la revisión de Hirano en 2000 [29] ). Este complejo se conoce como complejo de cohesina y en Saccharomyces cerevisiae está compuesto por al menos cuatro subunidades: Smc1p, Smc3p, Scc1p (o Mcd1p) y Scc3p. Tanto Smc1p como Smc3p pertenecen a la familia de proteínas para el Mantenimiento Estructural de los Cromosomas (SMC), que constituyen un grupo de ATPasas cromosómicas altamente conservadas, y forman un heterodímero (Smc1p/Smc3p). Scc1p es el homólogo en S.cerevisiae de Rad21, identificado por primera vez como una proteína implicada en la reparación del ADN en S. pombe . Estas cuatro proteínas son esenciales en la levadura y una mutación en cualquiera de ellas producirá una separación prematura de las cromátidas hermanas. En la levadura, la cohesina se une a sitios preferenciales a lo largo de los brazos de los cromosomas y es muy abundante cerca de los centrómeros, como se demostró en un estudio que utilizó inmunoprecipitación de cromatina. [30]
Las observaciones citológicas clásicas sugirieron que las cromátidas hermanas están más fuertemente unidas en las regiones heterocromáticas , [31] y esto sugirió que la estructura o composición especial de la heterocromatina podría favorecer el reclutamiento de cohesina. [32] De hecho, se ha demostrado que Swi6 (el homólogo de HP-1 en S. pombe ) se une a la Lys 9 metilada de la histona H3 y promueve la unión de la cohesina a las repeticiones centroméricas en S. pombe . [33] [34] Estudios más recientes indican que la maquinaria de ARNi regula el establecimiento de heterocromatina, que a su vez recluta cohesina en esta región, tanto en S. pombe [35] como en células de vertebrados. [36] Sin embargo, debe haber otros mecanismos además de la heterocromatina para garantizar una cohesión aumentada en los centrómeros, porque S. cerevisiae carece de heterocromatina junto a los centrómeros, pero la presencia de un centrómero funcional induce un aumento de la asociación de cohesina en una región contigua, que abarca 20 -50kb. [37]
En esta dirección, Orc2 (una proteína incluida en el complejo de reconocimiento de origen , ORC, implicada en el inicio de la replicación del ADN durante la fase S ) también se localiza en los cinetocoros durante la mitosis en células humanas; [38] de acuerdo con esta localización, algunas observaciones indican que Orc2 en la levadura está implicado en la cohesión de las cromátidas hermanas, y su eliminación induce la activación del SAC. [39] También se ha observado que otros componentes del complejo ORC (como orc5 en S. pombe ) están implicados en la cohesión. [40] Sin embargo, la vía molecular que involucra a las proteínas ORC parece ser aditiva a la vía de las cohesinas y es en su mayor parte desconocida.
La cohesión centromérica resiste las fuerzas ejercidas por los microtúbulos del huso hacia los polos, que generan tensión entre cinetocoros hermanos. A su vez, esta tensión estabiliza la unión microtúbulo-cinetocoro, a través de un mecanismo que implica a la proteína Aurora B (una revisión sobre este tema: Hauf y Watanabe 2004 [41] ).
De hecho, una disminución de los niveles celulares de cohesina genera la separación prematura de las cromátidas hermanas, así como defectos en el congreso cromosómico en la placa metafásica y la deslocalización de las proteínas en el complejo cromosómico pasajero , que contiene la proteína Aurora B. [42] [43] La estructura propuesta para el complejo de cohesina sugiere que este complejo conecta directamente ambas cromátidas hermanas. [44] En esta estructura propuesta, los componentes SMC de la cohesina desempeñan un papel estructural, de modo que el heterodímero SMC puede funcionar como una proteína de unión al ADN, cuya conformación está regulada por ATP . [45] Scc1p y Scc3p, sin embargo, desempeñarían un papel regulador. [29]
En S. cerevisiae , Pds1p (también conocida como securina ) regula la cohesión de las cromátidas hermanas, porque se une e inhibe la proteasa Esp1p ( separina o separasa ). Cuando se desencadena el inicio de la anafase, el complejo promotor de la anafase ( APC/C o ciclosoma) degrada la securina. APC/C es una ubiquitina ligasa del anillo E3 que recluta una enzima conjugadora de ubiquitina E2 cargada con ubiquitina. La securina se reconoce sólo si Cdc20, la subunidad activadora, está unida al núcleo APC/C. Cuando la securina, Cdc20 y E2 están unidos a APC/C, E2 ubiquitina la securina y la degrada selectivamente. La degradación de la securina libera la proteasa Esp1p/separasa, que degrada los anillos de cohesina que unen las dos cromátidas hermanas, promoviendo así la separación de las cromátidas hermanas. [46] También se ha demostrado que la quinasa Polo/Cdc5 fosforila los residuos de serina próximos al sitio de corte para Scc1, y esta fosforilación facilitaría la actividad de corte. [47]
Aunque esta maquinaria se conserva a lo largo de la evolución, [48] [49] en los vertebrados la mayoría de las moléculas de cohesina se liberan en profase, independientemente de la presencia de APC/C, en un proceso dependiente de Polo-like 1 ( PLK1 ) y Aurora B. [50] Sin embargo, se ha demostrado que una pequeña cantidad de Scc1 permanece asociada a los centrómeros en las células humanas hasta la metafase, y una cantidad similar se corta en la anafase, cuando desaparece de los centrómeros. [51] Por otro lado, algunos experimentos muestran que la cohesión de las cromátidas hermanas en los brazos se pierde gradualmente después de que los centrómeros hermanos se han separado, y las cromátidas hermanas se mueven hacia los polos opuestos de la célula. [52] [53]
Según algunas observaciones, una fracción de las cohesinas de los brazos cromosómicos y las cohesinas centroméricas están protegidas por la proteína Shugoshin (Sgo1), evitando su liberación durante la profase. [54] [55] Para poder funcionar como protector de la cohesión centromérica, Sgo1 debe estar inactivado al inicio de la anafase, así como Pds1p. De hecho, tanto Pds1p como Sgo1 son sustratos de APC/C en vertebrados. [56]
En los ovocitos de ratón , el daño del ADN induce la detención de la profase meiótica I , mediada por el punto de control del ensamblaje del huso. [57] Los ovocitos detenidos no ingresan a la etapa posterior, anafase I. Las roturas de la doble cadena del ADN, los rayos UVB y el daño al ADN inducido por radiación ionizante causan un bloqueo efectivo de la anafase que promueve la actividad compleja. [57] Este punto de control puede ayudar a evitar que los ovocitos con ADN dañado progresen hasta convertirse en óvulos maduros fertilizables. [57] Durante la detención de la profase, los ovocitos de ratón parecen utilizar tanto la reparación recombinante homóloga como la unión de extremos no homólogos para reparar las roturas de la doble hebra del ADN. [58]
El punto de control del ensamblaje del huso (SAC) es una señal activa producida por cinetocoros mal unidos , que se conserva en todos los eucariotas . El SAC detiene el ciclo celular regulando negativamente CDC20, evitando así la activación de las actividades de poliubiquitinación del complejo promotor de la anafase (APC). Las proteínas responsables de la señal SAC componen el complejo de punto de control mitótico (MCC), que incluye proteínas SAC, MAD2 /MAD3 (deficiencia de parada mitótica), BUB3 (gemación no inhibida por bencimidazol) y CDC20 . [59] Otras proteínas involucradas en el SAC incluyen MAD1 , BUB1 , MPS1 y Aurora B. Para eucariotas superiores, los reguladores adicionales del SAC incluyen componentes del complejo ROD-ZW10 , p31comet, MAPK , CDK1-ciclina-B , NEK2 y PLK1 . [60]
El SAC monitorea la interacción entre los cinetocoros mal conectados y los microtúbulos del huso , y se mantiene hasta que los cinetocoros estén correctamente unidos al huso. Durante la prometafase , las proteínas CDC20 y SAC se concentran en los cinetocoros antes de unirse al conjunto del huso. Estas proteínas mantienen el SAC activado hasta que se eliminan y se realiza la correcta unión cinetocoro-microtúbulos. Incluso un único cinetocoro no adherido puede mantener el punto de control del huso. [59] Después de la unión de los extremos positivos de los microtúbulos y la formación de microtúbulos cinetocoros, MAD1 y MAD2 se agotan del conjunto del cinetocoro. Otro regulador de la activación del punto de control es la tensión del cinetocoro. Cuando los cinetocoros hermanos están adecuadamente unidos a los polos opuestos del huso, las fuerzas en el huso mitótico generan tensión en los cinetocoros. Los cinetocoros hermanos biorientados estabilizan el conjunto cinetocoro-microtúbulos, mientras que la tensión débil tiene un efecto desestabilizador. En respuesta a uniones incorrectas del cinetocoro, como la unión sintética , donde ambos cinetocoros se unen a un polo del huso, la tensión débil generada desestabiliza la unión incorrecta y permite que el cinetocoro se vuelva a unir correctamente al cuerpo del huso. Durante este proceso, los cinetocoros que están unidos al huso mitótico pero que no están bajo tensión activan el punto de control del huso. La quinasa Aurora-B/Ipl1 del complejo cromosómico pasajero funciona como sensor de tensiones en uniones cinetocoras inadecuadas. Detecta y desestabiliza las uniones incorrectas mediante el control de la cinesina MCAK KINI que corta los microtúbulos, el complejo DASH y el complejo Ndc80/Hec1 [61] en la interfaz microtúbulo-cinetocoro. [60] La quinasa Aurora-B/Ipl1 también es fundamental para corregir las uniones merotélicas , donde un cinetocoro está unido simultáneamente a ambos polos del huso. Las uniones merotélicas generan suficiente tensión y el SAC no las detecta y, sin corrección, pueden provocar una mala segregación cromosómica debido a la lenta velocidad de migración de las cromátidas. Si bien la unión de los microtúbulos se requiere de forma independiente para la activación del SAC, no está claro si la tensión es un regulador independiente del SAC, aunque está claro que con la tensión surgen diferentes comportamientos regulatorios.
Una vez activado, el punto de control del huso bloquea la entrada a la anafase inhibiendo el complejo promotor de la anafase mediante la regulación de la actividad del complejo del punto de control mitótico. El mecanismo de inhibición de APC por el complejo de punto de control mitótico no se conoce bien, aunque se plantea la hipótesis de que MCC se une a APC como un pseudosustrato utilizando el motivo de caja KEN en BUBR1. Al mismo tiempo que se activa el complejo del punto de control mitótico, la proteína centrómero CENP-E activa BUBR1, que también bloquea la anafase. [60]
El complejo del punto de control mitótico está compuesto por BUB3 junto con MAD2 y MAD3 unidos a Cdc20 . MAD2 y MAD3 tienen sitios de unión distintos en CDC20 y actúan sinérgicamente para inhibir APC/C. El complejo MAD3 está compuesto por BUB3, que se une a Mad3 y BUB1B a través del motivo lineal corto conocido como motivo GLEBS. Se desconoce el orden exacto de las uniones que deben tener lugar para formar el MCC. Es posible que Mad2-Cdc20 forme un complejo al mismo tiempo que BUBR1-BUB3-Cdc20 forme otro complejo y, en consecuencia, estos dos subcomplejos se combinen para formar el complejo del punto de control mitótico. [59] En las células humanas, la unión de BUBR1 a CDC20 requiere la unión previa de MAD2 a CDC20, por lo que es posible que el subcomplejo MAD2-CDC20 actúe como iniciador de la formación de MCC. El agotamiento de BUBR1 conduce sólo a una leve reducción en los niveles de Mad2-Cdc20, mientras que Mad2 es necesario para la unión de BubR1-Bub3 a Cdc20. Sin embargo, todavía se requiere BUBR1 para la activación del punto de control. [60]
El mecanismo de formación del MCC no está claro y existen teorías en competencia para la formación tanto dependiente como independiente del cinetocoro. En apoyo de la teoría independiente del cinetocoro, el MCC es detectable en células de S. cerevisiae en las que se han mutado las proteínas centrales de ensamblaje del cinetocoro y en las células en las que se ha desactivado el SAC, lo que sugiere que el MCC podría ensamblarse durante la mitosis sin localización del cinetocoro. En un modelo, los cinetocoros de prometafase no unidos pueden "sensibilizar" a la APC a la inhibición de MCC reclutando la APC para los cinetocoros a través de un SAC en funcionamiento. Además, el agotamiento de varias proteínas del SAC ha revelado que el agotamiento de MAD2 y BUBR1 afecta el momento de la mitosis independientemente de los cinetocoros, mientras que el agotamiento de otras proteínas del SAC da como resultado un SAC disfuncional sin alterar la duración de la mitosis. Por lo tanto, es posible que el SAC funcione a través de un temporizador de dos etapas donde MAD2 y BUBR1 controlan la duración de la mitosis en la primera etapa, que puede extenderse en la segunda etapa si hay cinetocoros no unidos, así como otras proteínas del SAC. [60] Sin embargo, hay líneas de evidencia que están en contra del ensamblaje independiente del cinetocoro. MCC aún no se ha encontrado durante la interfase , mientras que MCC no se forma a partir de sus constituyentes en extractos de meiosis II de X. laevis sin la adición de esperma de núcleos y nocodazol para evitar el ensamblaje del huso.
El modelo principal de formación de MCC es el "modelo de plantilla MAD2", que depende de la dinámica del cinetocoro de MAD2 para crear el MCC. MAD1 se localiza en cinetocoros no unidos mientras se une fuertemente a MAD2. La localización de MAD2 y BubR1 en el cinetocoro también puede depender de la quinasa Aurora B. [62] Las células que carecen de Aurora B no se detienen en la metafase incluso cuando los cromosomas carecen de unión a microtúbulos. [63] Los cinetocoros no unidos primero se unen a un complejo cometario MAD1-C-MAD2-p31 y liberan el cometa p31 a través de mecanismos desconocidos. El complejo MAD1-C-MAD2 resultante recluta el confórmero abierto de Mad2 (O-Mad2) para los cinetocoros. Este O-Mad2 cambia su conformación a Mad2 cerrado (C-Mad2) y se une a Mad1. Este complejo Mad1/C-Mad2 es responsable del reclutamiento de más O-Mad2 en los cinetocoros, lo que cambia su conformación a C-Mad2 y se une a Cdc20 en una reacción de autoamplificación. Dado que MAD1 y CDC20 contienen un motivo de unión a MAD2 similar, la conformación O-MAD2 vacía cambia a C-MAD2 mientras se une a CDC20. Este circuito de retroalimentación positiva está regulado negativamente por el cometa p31 , que se une competitivamente a C-MAD2 unido a MAD1 o CDC20 y reduce aún más la unión de O-MAD2 a C-MAD2. También pueden existir otros mecanismos de control, considerando que el cometa p31 no está presente en los eucariotas inferiores. La nomenclatura de 'modelo de plantilla' se deriva, por tanto, del proceso en el que MAD1-C-MAD2 actúa como plantilla para la formación de copias de C-MAD2-CDC20. Este secuestro de Cdc20 es esencial para mantener el punto de control del husillo. [59]
Existen varios mecanismos para desactivar el SAC después de una correcta biorientación de las cromátidas hermanas . Tras la unión microtúbulo-cinetocoro, un mecanismo de extracción a través de un complejo motor dineína-dineína transporta las proteínas del punto de control del huso lejos de los cinetocoros. [60] Las proteínas despojadas, que incluyen MAD1, MAD2, MPS1 y CENP-F , luego se redistribuyen a los polos del huso . El proceso de extracción depende en gran medida de la estructura de los microtúbulos no dañada, así como de la motilidad de la dineína a lo largo de los microtúbulos. Además de funcionar como regulador del circuito de retroalimentación positiva C-MAD2, el cometa p31 también puede actuar como desactivador del SAC. Los cinetocoros no unidos inactivan temporalmente el cometa p31 , pero la unión reactiva la proteína e inhibe la activación de MAD2, posiblemente mediante fosforilación inhibidora. Otro posible mecanismo de inactivación de SAC resulta de la disociación dependiente de energía del complejo MAD2-CDC20 mediante la ubiquitilación no degradativa de CDC20. Por el contrario, se requiere la enzima desubiquitilante protetina para mantener el SAC. Por lo tanto, los cinetocoros no unidos mantienen el punto de control recreando continuamente el subcomplejo MAD2-CDC20 a partir de sus componentes. El SAC también puede desactivarse mediante proteólisis inducida por la activación de APC . Dado que el SAC no se reactiva por la pérdida de cohesión de las cromátidas hermanas durante la anafase, la proteólisis de la ciclina B y la inactivación de la quinasa CDK1-ciclina-B también inhibe la actividad del SAC. La degradación de MPS1 durante la anafase previene la reactivación de SAC después de la eliminación de la cohesión de las cromátidas hermanas. Después de la desactivación del punto de control y durante la anafase normal del ciclo celular, el complejo promotor de la anafase se activa disminuyendo la actividad del MCC. Cuando esto sucede, el complejo enzimático poliubiquitina el inhibidor de la anafase securina . La ubiquitinación y destrucción de la securina al final de la metafase libera la proteasa activa llamada separasa. La separasa escinde las moléculas de cohesión que mantienen unidas a las cromátidas hermanas para activar la anafase. [23]
Se ha sugerido un nuevo mecanismo para explicar cómo la unión terminal de los microtúbulos al cinetocoro puede alterar pasos específicos en la señalización del SAC. En un cinetocoro no adherido, el primer paso en la formación del MCC es la fosforilación de Spc105 por la quinasa Mps1. El Spc105 fosforilado puede entonces reclutar las proteínas de señalización posteriores Bub1 y 3; Loco 1,2 y 3; y Cdc20. La asociación con Mad1 en cinetocoros no unidos hace que Mad2 sufra un cambio conformacional que lo convierte de una forma abierta (O-Mad2) a una forma cerrada (C-Mad2). El C-Mad2 unido a Mad1 luego se dimeriza con un segundo O-Mad2. y cataliza su cierre alrededor de Cdc20. Este complejo C-Mad2 y Cdc20, el MCC, deja Mad1 y C-Mad2 en el cinetocoro para formar otro MCC. Cada uno de los MCC secuestra dos moléculas de Cdc20 para evitar su interacción con el APC/C, manteniendo así el SAC. [23] La fosforilación de Spc105 por parte de Mps1 es necesaria y suficiente para iniciar la vía de señalización SAC, pero este paso solo puede ocurrir en ausencia de unión de microtúbulos al cinetocoro. Se muestra que Mps1 endógeno se asocia con el dominio de homología de calponina (CH) de Ndc80, que se encuentra en la región del cinetocoro externo que está distante del cromosoma. Aunque Mps1 está acoplado en el cinetocoro externo, todavía puede localizarse dentro del cinetocoro interno y fosforilar Spc105 debido a las regiones de bisagra flexibles en Ndc80. Sin embargo, el modelo de interruptor mecánico propone que la unión terminal de un microtúbulo al cinetocoro desactiva el SAC a través de dos mecanismos. La presencia de un microtúbulo adjunto aumenta la distancia entre el dominio CH Ndc80 y Spc105. Además, Dam1/DASH, un gran complejo que consta de 160 proteínas que forma un anillo alrededor del microtúbulo adjunto, actúa como una barrera entre las dos proteínas. La separación previene las interacciones entre Mps1 y Spc105 y, por tanto, inhibe la vía de señalización SAC. [64]
Es importante señalar que este modelo no es aplicable a la regulación SAC en organismos de orden superior, incluidos los animales. Una faceta principal del mecanismo de interruptor mecánico es que en S. cerevisiae la estructura del cinetocoro solo permite la unión de un microtúbulo. Los cinetocoros en los animales, por otro lado, son redes mucho más complejas que contienen sitios de unión para una multitud de microtúbulos. [65] La unión de microtúbulos en todos los sitios de unión del cinetocoro no es necesaria para la desactivación del SAC y la progresión a anafase. Por lo tanto, los estados de microtúbulos unidos y no unidos coexisten en el cinetocoro animal mientras el SAC está inhibido. Este modelo no incluye una barrera que evitaría que Mps1 asociado con un cinetocoro adjunto fosforile a Spc105 en un cinetocoro adyacente no adjunto. Además, el complejo de levadura Dam1/DASH no está presente en las células animales.
Cuando el punto de control del huso no funciona correctamente, esto puede provocar una segregación errónea de los cromosomas, aneuploidía e incluso tumorigénesis . [60] La transformación ocurre y se acelera cuando el mantenimiento de la integridad genómica se rompe, especialmente en el nivel macroscópico de cromosomas completos o grandes porciones de ellos. De hecho, la aneuploidía es la característica más común de los tumores sólidos humanos y, por lo tanto, el punto de control del ensamblaje del huso podría considerarse un posible objetivo para la terapia antitumoral. [66] Este es un hecho muy subestimado, ya que se cree que las mutaciones en genes específicos conocidos como oncogenes o supresores de tumores están principalmente detrás de la inestabilidad genética y la tumorigénesis. Por lo general, los diversos puntos de control del ciclo celular se encargan de la integridad genómica mediante mecanismos redundantes altamente conservados que son importantes para mantener la homeostasis celular y prevenir la tumorigénesis. Varias proteínas de punto de control del ensamblaje del huso actúan como reguladores positivos y negativos para garantizar la segregación cromosómica adecuada en cada ciclo celular, previniendo la inestabilidad cromosómica (CIN), también conocida como inestabilidad del genoma .
La integridad genómica ahora se aprecia en varios niveles donde algunos tumores muestran inestabilidad manifestada como sustituciones, inserciones y eliminaciones de bases, mientras que la mayoría muestra ganancias o pérdidas de cromosomas completos. [67]
Debido a que las alteraciones en las proteínas reguladoras mitóticas pueden provocar aneuploidía y este es un evento frecuente en el cáncer , [68] inicialmente se pensó que estos genes podrían estar mutados en tejidos cancerosos. [69]
En algunos cánceres, los genes que subyacen a los defectos que dan lugar a la transformación están bien caracterizados. En los cánceres hematológicos, como el mieloma múltiple, las anomalías citogenéticas son muy comunes debido a la naturaleza inherente de las roturas del ADN necesarias para el reordenamiento del gen de las inmunoglobulinas. Sin embargo, los defectos en proteínas como MAD2 que funcionan predominantemente en el SAC también se caracterizan en el mieloma múltiple. [70] La mayoría de los tumores sólidos también son predominantemente aneuploides. Para el cáncer colorrectal, BUB1 y BUBR1 y la amplificación de STK15 son reguladores clave que se han implicado en la inestabilidad genómica que provoca el cáncer. [71] En el cáncer de mama, la forma genética caracterizada por el gen BRCA-1 exhibe mayores niveles de inestabilidad genómica que las formas esporádicas. Los experimentos demostraron que los ratones con BRCA-1 nulo tenían una expresión disminuida de la proteína clave del punto de control del huso MAD2. [72] Para otros cánceres, se justifica realizar más trabajo para identificar las causas de la aneuploidía.
Claramente las variaciones en los niveles fisiológicos de estas proteínas (como Mad2 o BubR1) están asociadas con aneuploidía y tumorigénesis, y esto se ha demostrado utilizando modelos animales . [73] [74] Sin embargo, estudios recientes indican que lo que parece suceder es un escenario más complicado: la aneuploidía generaría una alta incidencia de tumorigénesis solo cuando se producen alteraciones en los niveles de componentes específicos de los puntos de control mitóticos (ya sea reducción o sobreexpresión) en los tejidos. induciendo también otros defectos capaces de predisponerlos a tumores. [75] Es decir, defectos como un aumento en el daño del ADN, reordenamientos cromosómicos y/o una menor incidencia de muerte celular. Para algunos componentes del punto de control mitótico, se sabe que están implicados en funciones fuera de la mitosis: importación nuclear (Mad1), represión transcripcional (Bub3) y muerte celular, respuesta al daño del ADN, envejecimiento y megacariopoyesis para BubR1. Todo esto apoya la conclusión de que el aumento de la tumorigénesis se asocia con defectos distintos de la aneuploidía únicamente. [75]
Las mutaciones asociadas al cáncer que afectan a genes de puntos de control conocidos como BUB1 o BUBR1 son en realidad raras. Sin embargo, varias proteínas implicadas en el cáncer tienen intersecciones con las redes de ensamblaje del huso. Los supresores de tumores clave, como p53, también desempeñan un papel en el punto de control del huso. La ausencia de p53, el gen mutado con mayor frecuencia en el cáncer humano, tiene un efecto importante sobre los reguladores del punto de control del ciclo celular y se ha demostrado que actúa en el punto de control G1 en el pasado, pero ahora parece ser importante también en la regulación del punto de control del huso. [76] Otro aspecto clave del cáncer es la inhibición de la muerte celular o apoptosis . La survivina , un miembro de la familia de inhibidores de la apoptosis (IAP), se localiza en grupos de microtúbulos del huso mitótico cerca de los centrosomas y en los cinetocoros de los cromosomas en metafase. La survivina no solo inhibe la apoptosis para promover la tumorigénesis, sino que también se la ha implicado (a través de ratones knockout experimentales) como un importante regulador de la segregación cromosómica y de la mitosis en etapas tardías similar a su papel en organismos más primitivos. [77]
Es probable que otros aspectos del punto de control del ensamblaje del huso, como la unión del cinetocoro, la función de los microtúbulos y la cohesión de las cromátidas hermanas, sean defectuosos y causen aneuploidía. Se ha observado que las células cancerosas se dividen en múltiples direcciones al evadir el punto de control del ensamblaje del huso, lo que da como resultado mitosis multipolares. [78] La transición multipolar metafase-anafase ocurre a través de un ciclo de separasa incompleto que resulta en eventos frecuentes de no disyunción que amplifican la aneuploidía en las células cancerosas.
Los avances en este campo han llevado a la introducción del desarrollo de algunas terapias dirigidas a los defectos de ensamblaje del husillo. Los tratamientos más antiguos, como los alcaloides de la vinca y los taxanos, se dirigen a los microtúbulos que acompañan a la formación del huso mitótico mediante la interrupción de la dinámica de los microtúbulos que activan el SAC, detiene la célula y, finalmente, conduce a su muerte. [79] El taxol y el docetaxel , que pueden inducir una catástrofe mitótica , todavía se utilizan en el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de ovario y otros tipos de cáncer epitelial. [80] Sin embargo, estos tratamientos a menudo se caracterizan por altas tasas de efectos secundarios y resistencia a los medicamentos.
También se están persiguiendo otros objetivos dentro de la red de reguladores que influyen en la SAC; Un gran interés se ha desplazado hacia las proteínas Aurora quinasa . [81] El gen de la quinasa Aurora A, cuando se amplifica, actúa como un oncogén que anula el SAC, lo que conduce a un inicio anormal de la anafase y a una aneuploidía posterior y también a la resistencia al TAXOL. [82] Curiosamente, una molécula pequeña inhibidora de Aurora A ha mostrado efectos antitumorales en un modelo in vivo, lo que sugiere que este podría ser un buen objetivo para un mayor desarrollo clínico. [83] Los inhibidores de Aurora B , que también se encuentran en desarrollo clínico, provocan una unión anormal del cinetocoro a los microtúbulos y también anulan el punto de control mitótico. [81] La survivina también es un objetivo molecular atractivo para el desarrollo terapéutico clínico, ya que actúa como un nodo importante en una multitud de vías, una de las cuales es la formación del huso y el control de los puntos de control. [84] Incluso otros enfoques han incluido una mirada a la inhibición de proteínas motoras mitóticas como KSP. Estos inhibidores, que han entrado recientemente en ensayos clínicos, provocan una parada mitótica y, al activar el punto de control del conjunto del huso, inducen la apoptosis. [85] [3]
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