Los genomas bacterianos son generalmente más pequeños y menos variables en tamaño entre especies en comparación con los genomas de eucariotas . Los genomas bacterianos pueden variar en tamaño desde aproximadamente 130 kbp [1] [2] hasta más de 14 Mbp . [3] Un estudio que incluyó, entre otros, 478 genomas bacterianos, concluyó que a medida que aumenta el tamaño del genoma, el número de genes aumenta a un ritmo desproporcionadamente más lento en eucariotas que en no eucariotas. Por lo tanto, la proporción de ADN no codificante aumenta con el tamaño del genoma más rápidamente en las no bacterias que en las bacterias . Esto es consistente con el hecho de que la mayor parte del ADN nuclear de eucariotas no codifica genes, mientras que la mayoría de los genes procarióticos, virales y orgánulos sí lo son. [4] En este momento, tenemos secuencias genómicas de 50 filos bacterianos diferentes y 11 filos arqueales diferentes. La secuenciación de segunda generación ha producido muchos borradores de genomas (cerca del 90% de los genomas bacterianos en GenBank actualmente no están completos); La secuenciación de tercera generación podría eventualmente producir un genoma completo en unas pocas horas. Las secuencias del genoma revelan mucha diversidad en las bacterias. El análisis de más de 2.000 genomas de Escherichia coli revela un genoma central de E. coli de aproximadamente 3.100 familias de genes y un total de aproximadamente 89.000 familias de genes diferentes. [5] Las secuencias del genoma muestran que las bacterias parásitas tienen entre 500 y 1200 genes, las bacterias de vida libre tienen entre 1500 y 7500 genes y las arqueas tienen entre 1500 y 2700 genes. [6] Un descubrimiento sorprendente de Cole et al. describieron cantidades masivas de descomposición genética al comparar el bacilo de la lepra con bacterias ancestrales. [7] Desde entonces, los estudios han demostrado que varias bacterias tienen tamaños de genoma más pequeños que los de sus antepasados. [8] A lo largo de los años, los investigadores han propuesto varias teorías para explicar la tendencia general de descomposición del genoma bacteriano y el tamaño relativamente pequeño de los genomas bacterianos. Evidencia convincente indica que la aparente degradación de los genomas bacterianos se debe a un sesgo de eliminación.
En 2014, hay más de 30.000 genomas bacterianos secuenciados disponibles públicamente y miles de proyectos de metagenomas . Proyectos como la Enciclopedia Genómica de Bacterias y Arqueas (GEBA) pretenden añadir más genomas. [5]
La comparación de un solo gen está siendo suplantada por métodos más generales. Estos métodos han dado lugar a nuevas perspectivas sobre las relaciones genéticas que antes sólo se habían estimado. [5]
Un logro significativo en la segunda década de la secuenciación del genoma bacteriano fue la producción de datos metagenómicos, que cubren todo el ADN presente en una muestra. Anteriormente, sólo se habían publicado dos proyectos metagenómicos. [5]
Las bacterias poseen una arquitectura genómica compacta distinta de la de los eucariotas en dos aspectos importantes: las bacterias muestran una fuerte correlación entre el tamaño del genoma y la cantidad de genes funcionales en un genoma, y esos genes están estructurados en operones . [9] [10] La razón principal de la densidad relativa de los genomas bacterianos en comparación con los genomas eucariotas (especialmente los eucariotas multicelulares) es la presencia de ADN no codificante en forma de regiones intergénicas e intrones . [10] Algunas excepciones notables incluyen bacterias patógenas formadas recientemente. Esto fue descrito inicialmente en un estudio de Cole et al . en el que se descubrió que Mycobacterium leprae tenía un porcentaje significativamente mayor de pseudogenes a genes funcionales (~40%) que sus ancestros de vida libre. [7]
Además, entre las especies de bacterias, hay relativamente poca variación en el tamaño del genoma en comparación con los tamaños del genoma de otros grupos importantes de vida. [6] El tamaño del genoma tiene poca relevancia cuando se considera el número de genes funcionales en especies eucariotas. Sin embargo, en las bacterias, la fuerte correlación entre el número de genes y el tamaño del genoma hace que el tamaño de los genomas bacterianos sea un tema interesante de investigación y discusión. [11]
Las tendencias generales de la evolución bacteriana indican que las bacterias comenzaron como organismos de vida libre. Los caminos evolutivos llevaron a algunas bacterias a convertirse en patógenos y simbiontes . Los estilos de vida de las bacterias desempeñan un papel integral en el tamaño de sus respectivos genomas. Las bacterias de vida libre tienen los genomas más grandes de los tres tipos de bacterias; sin embargo, tienen menos pseudogenes que las bacterias que han adquirido patogenicidad recientemente .
Las bacterias patógenas facultativas y recientemente evolucionadas exhiben un tamaño de genoma más pequeño que las bacterias de vida libre, pero tienen más pseudogenes que cualquier otra forma de bacteria.
Los simbiontes bacterianos obligados o patógenos tienen los genomas más pequeños y la menor cantidad de pseudogenes de los tres grupos. [12] La relación entre los estilos de vida de las bacterias y el tamaño del genoma plantea dudas sobre los mecanismos de evolución del genoma bacteriano. Los investigadores han desarrollado varias teorías para explicar los patrones de evolución del tamaño del genoma entre las bacterias.
A medida que las comparaciones de un solo gen han dado paso en gran medida a las comparaciones de genomas, la filogenia de los genomas bacterianos ha mejorado en precisión. El método de identidad promedio de nucleótidos (ANI) cuantifica la distancia genética entre genomas completos aprovechando regiones de aproximadamente 10.000 pb. Con suficientes datos de genomas de un género, se ejecutan algoritmos para categorizar especies. Esto se hizo para la especie Pseudomonas avellanae en 2013 [5] y para todas las bacterias y arqueas secuenciadas desde 2020. [13] Los valores de ANI observados entre secuencias parecen tener una "brecha de ANI" del 85 al 95 %, lo que sugiere que una genética Existe un límite adecuado para definir un concepto de especie. [14]
Para extraer información sobre los genomas bacterianos, se han evaluado los tamaños del núcleo y del pangenoma de varias cepas de bacterias. En 2012, el número de familias de genes centrales era de aproximadamente 3000. Sin embargo, en 2015, con un aumento de más de diez veces en los genomas disponibles, el pangenoma también aumentó. Existe aproximadamente una correlación positiva entre el número de genomas agregados y el crecimiento del pangenoma. Por otro lado, el genoma central permanece estático desde 2012. Actualmente, el pangenoma de E. coli está compuesto por unas 90.000 familias de genes. Aproximadamente un tercio de ellos existen sólo en un único genoma. Muchos de ellos, sin embargo, son meros fragmentos de genes y el resultado de errores de llamada. Aun así, es probable que existan más de 60.000 familias de genes únicas en E. coli . [5]
Las bacterias pierden una gran cantidad de genes a medida que pasan de ciclos de vida de vida libre o facultativamente parásitos a una vida permanente dependiente del huésped. Hacia el extremo inferior de la escala de tamaño del genoma bacteriano se encuentran los micoplasmas y bacterias relacionadas. Los primeros estudios filogenéticos moleculares revelaron que los micoplasmas representaban un estado derivado de la evolución, contrariamente a las hipótesis anteriores. Además, ahora se sabe que los micoplasmas son sólo un ejemplo de muchos casos de reducción del genoma en bacterias estrictamente asociadas al huésped. Otros ejemplos son Rickettsia , Buchnera aphidicola y Borrelia burgdorferi . [15]
El tamaño pequeño del genoma en tales especies se asocia con ciertas particularidades, como la rápida evolución de las secuencias polipeptídicas y el bajo contenido de GC en el genoma. La evolución convergente de estas cualidades en bacterias no relacionadas sugiere que una asociación obligada con un huésped promueve la reducción del genoma. [15]
Dado que más del 80% de casi todos los genomas bacterianos completamente secuenciados consisten en ORF intactos, y que la longitud del gen es casi constante en ~1 kb por gen, se infiere que los genomas pequeños tienen pocas capacidades metabólicas. Mientras que las bacterias de vida libre, como E. coli , especies de Salmonella o especies de Bacillus , suelen tener entre 1.500 y 6.000 proteínas codificadas en su ADN, las bacterias estrictamente patógenas suelen tener tan solo entre 500 y 1.000 de estas proteínas. [15]
Una posible explicación es que los genomas reducidos mantienen genes que son necesarios para procesos vitales relacionados con el crecimiento y la replicación celular , además de aquellos genes que se requieren para sobrevivir en el nicho ecológico de la bacteria . Sin embargo, los datos de secuencia contradicen esta hipótesis. El conjunto de ortólogos universales entre las eubacterias comprende sólo el 15% de cada genoma. Así, cada linaje ha tomado un camino evolutivo diferente hacia un tamaño reducido. Debido a que los procesos celulares universales requieren más de 80 genes, la variación en los genes implica que se pueden lograr las mismas funciones mediante la explotación de genes no homólogos. [15]
Las bacterias dependientes del huésped pueden obtener muchos compuestos necesarios para el metabolismo del citoplasma o tejido del huésped. A su vez, pueden descartar sus propias vías biosintéticas y genes asociados. Esta eliminación explica muchas de las pérdidas de genes específicos. Por ejemplo, la especie Rickettsia , que depende de un sustrato energético específico de su huésped, ha perdido muchos de sus genes nativos del metabolismo energético. De manera similar, la mayoría de los genomas pequeños han perdido sus genes biosintetizadores de aminoácidos , ya que estos se encuentran en el huésped. Una excepción es la Buchnera , un simbionte obligado de pulgones de transmisión materna. Conserva 54 genes para la biosíntesis de aminoácidos cruciales, pero ya no tiene vías para aquellos aminoácidos que el huésped puede sintetizar. Las vías para la biosíntesis de nucleótidos han desaparecido de muchos genomas reducidos. Esas vías anabólicas que evolucionaron a través de la adaptación de nichos permanecen en genomas particulares. [15]
La hipótesis de que los genes no utilizados finalmente se eliminan no explica por qué muchos de los genes eliminados seguirían siendo útiles en los patógenos obligados. Por ejemplo, muchos genes eliminados codifican productos que participan en procesos celulares universales, incluida la replicación, la transcripción y la traducción . Incluso los genes que apoyan la recombinación y reparación del ADN se eliminan de cada genoma pequeño. Además, los genomas pequeños tienen menos ARNt , utilizando uno para varios aminoácidos. Por lo tanto, un solo codón se empareja con múltiples codones, lo que probablemente produce una maquinaria de traducción que no es óptima. Se desconoce por qué los patógenos intracelulares obligados se beneficiarían al retener menos ARNt y menos enzimas reparadoras del ADN. [15]
Otro factor a considerar es el cambio de población que corresponde a una evolución hacia una vida obligadamente patógena. Tal cambio en el estilo de vida a menudo resulta en una reducción en el tamaño de la población genética de un linaje, ya que hay un número finito de huéspedes que ocupar. Esta deriva genética puede dar lugar a la fijación de mutaciones que inactivan genes que de otro modo serían beneficiosos o pueden disminuir la eficiencia de los productos genéticos. Por lo tanto, no sólo se perderán genes inútiles (ya que las mutaciones los alteran una vez que la bacteria se ha asentado en la dependencia del huésped), sino que también se pueden perder genes beneficiosos si la deriva genética impone una selección purificadora ineficaz . [15]
El número de genes mantenidos universalmente es pequeño e inadecuado para el crecimiento y la replicación celular independientes, de modo que las especies de genomas pequeños deben lograr tales hazañas mediante genes variables. Esto se hace en parte mediante el desplazamiento de genes no ortólogos. Es decir, la función de un gen es reemplazada por otro gen que logra la misma función. Se elimina la redundancia dentro del genoma ancestral, más grande. El contenido del genoma pequeño descendiente depende del contenido de deleciones cromosómicas que ocurren en las primeras etapas de la reducción del genoma. [15]
El genoma muy pequeño de M. genitalium posee genes prescindibles. En un estudio en el que se inactivaron genes individuales de este organismo mediante mutagénesis mediada por transposones, al menos 129 de sus 484 ORG no fueron necesarios para el crecimiento. Por tanto, es factible un genoma mucho más pequeño que el de M. genitalium . [15]
Una teoría predice que las bacterias tienen genomas más pequeños debido a una presión selectiva sobre el tamaño del genoma para asegurar una replicación más rápida. La teoría se basa en la premisa lógica de que los genomas bacterianos más pequeños tardarán menos en replicarse. Posteriormente, se seleccionarán preferentemente genomas más pequeños debido a una mayor aptitud física. Un estudio realizado por Mira et al. indicó poca o ninguna correlación entre el tamaño del genoma y el tiempo de duplicación . [16] Los datos indican que la selección no es una explicación adecuada para los pequeños tamaños de los genomas bacterianos. Aún así, muchos investigadores creen que existe cierta presión selectiva sobre las bacterias para mantener un tamaño de genoma pequeño .
La selección es sólo un proceso involucrado en la evolución. Otros dos procesos importantes ( mutación y deriva genética ) pueden explicar el tamaño del genoma de varios tipos de bacterias. Un estudio realizado por Mira et al. examinó el tamaño de las inserciones y eliminaciones en pseudogenes bacterianos. Los resultados indicaron que las eliminaciones mutacionales tienden a ser mayores que las inserciones en bacterias en ausencia de transferencia o duplicación de genes . [16] Las inserciones causadas por transferencia genética horizontal o lateral y duplicación de genes tienden a implicar la transferencia de grandes cantidades de material genético. Suponiendo que falten estos procesos, los genomas tenderán a reducirse de tamaño en ausencia de una restricción selectiva. La evidencia de un sesgo de eliminación está presente en los respectivos tamaños del genoma de bacterias de vida libre, parásitos facultativos y recientemente derivados y parásitos obligados y simbiontes .
Las bacterias de vida libre tienden a tener poblaciones de gran tamaño y están sujetas a más oportunidades de transferencia de genes. Como tal, la selección puede operar eficazmente en bacterias de vida libre para eliminar secuencias nocivas, lo que da como resultado un número relativamente pequeño de pseudogenes . Continuamente se hace evidente una mayor presión selectiva, ya que las bacterias de vida libre deben producir todos los productos genéticos independientemente del huésped. Dado que existen suficientes oportunidades para que se produzca la transferencia de genes y existen presiones selectivas contra eliminaciones incluso ligeramente perjudiciales, es intuitivo que las bacterias de vida libre deberían tener los genomas bacterianos más grandes de todos los tipos de bacterias.
Los parásitos recién formados sufren graves obstáculos y pueden depender del entorno del huésped para proporcionar productos genéticos. Así, en los parásitos recién formados y facultativos, existe una acumulación de pseudogenes y elementos transponibles debido a la falta de presión selectiva contra las deleciones. Los cuellos de botella de la población reducen la transferencia de genes y, como tal, el sesgo de eliminación garantiza la reducción del tamaño del genoma en las bacterias parásitas.
Los parásitos obligatorios y los simbiontes tienen los tamaños de genoma más pequeños debido a los efectos prolongados del sesgo de deleción. Los parásitos que han evolucionado para ocupar nichos específicos no están expuestos a mucha presión selectiva. Como tal, la deriva genética domina la evolución de bacterias de nicho específico. La exposición prolongada al sesgo de eliminación garantiza la eliminación de la mayoría de las secuencias superfluas. Los simbiontes se producen en cantidades drásticamente menores y sufren los cuellos de botella más graves de cualquier tipo bacteriano. Casi no hay oportunidad de transferencia de genes para las bacterias endosimbióticas y, por tanto, la compactación del genoma puede ser extrema. Uno de los genomas bacterianos más pequeños jamás secuenciados es el del endosimbionte Carsonella rudii . [17] Con 160 kbp, el genoma de Carsonella es uno de los ejemplos más simplificados de genoma examinado hasta la fecha.
La filogenética molecular ha revelado que cada clado de bacterias con tamaños de genoma inferiores a 2 Mb se deriva de ancestros con genomas mucho más grandes, refutando así la hipótesis de que las bacterias evolucionaron mediante la duplicación sucesiva de ancestros con genoma pequeño. [18] Estudios recientes realizados por Nilsson et al. examinó las tasas de reducción del genoma bacteriano de bacterias obligadas. Se cultivaron bacterias introduciendo cuellos de botella frecuentes y células en crecimiento en pases en serie para reducir la transferencia de genes e imitar las condiciones de las bacterias endosimbióticas. Los datos predijeron que las bacterias que exhiben un tiempo de generación de un día pierden hasta 1.000 kbp en tan solo 50.000 años (un período de tiempo evolutivo relativamente corto). Además, después de eliminar genes esenciales para el sistema de reparación de errores de coincidencia del ADN (MMR) dirigido por metilo, se demostró que la reducción del tamaño del genoma bacteriano aumentaba hasta 50 veces. [19] Estos resultados indican que la reducción del tamaño del genoma puede ocurrir relativamente rápido, y la pérdida de ciertos genes puede acelerar el proceso de compactación del genoma bacteriano.
Esto no quiere decir que todos los genomas bacterianos se estén reduciendo en tamaño y complejidad. Si bien muchos tipos de bacterias han reducido el tamaño del genoma desde un estado ancestral, todavía hay una gran cantidad de bacterias que mantuvieron o aumentaron el tamaño del genoma en estados ancestrales. [8] Las bacterias de vida libre experimentan poblaciones enormes, tiempos de generación rápidos y un potencial relativamente alto de transferencia de genes. Si bien el sesgo de eliminación tiende a eliminar secuencias innecesarias, la selección puede operar significativamente entre bacterias de vida libre, lo que resulta en la evolución de nuevos genes y procesos.
A diferencia de los eucariotas, que evolucionan principalmente mediante la modificación de la información genética existente, las bacterias han adquirido un gran porcentaje de su diversidad genética mediante la transferencia horizontal de genes . Esto crea genomas bastante dinámicos, en los que el ADN puede introducirse y extraerse del cromosoma. [20]
Las bacterias tienen más variaciones en sus propiedades metabólicas, estructuras celulares y estilos de vida de las que pueden explicarse únicamente por mutaciones puntuales. Por ejemplo, ninguno de los rasgos fenotípicos que distinguen a E. coli de Salmonella enterica puede atribuirse a una mutación puntual. Por el contrario, la evidencia sugiere que la transferencia horizontal de genes ha impulsado la diversificación y especiación de muchas bacterias. [20]
La transferencia horizontal de genes a menudo se detecta mediante información de secuencia de ADN. Los segmentos de ADN obtenidos mediante este mecanismo a menudo revelan una distribución filogenética estrecha entre especies relacionadas. Además, estas regiones a veces muestran un nivel inesperado de similitud con genes de taxones que se supone que son bastante divergentes. [20]
Aunque las comparaciones de genes y los estudios filogenéticos son útiles para investigar la transferencia horizontal de genes, las secuencias de ADN de los genes son aún más reveladoras de su origen y ascendencia dentro de un genoma. Las especies bacterianas difieren ampliamente en el contenido general de GC, aunque los genes en el genoma de cualquier especie son aproximadamente idénticos con respecto a la composición de bases, patrones de uso de codones y frecuencias de di y trinucleótidos. Como resultado, las secuencias recién adquiridas mediante transferencia lateral se pueden identificar a través de sus características, que siguen siendo las del donante. Por ejemplo, muchos de los genes de S. enterica que no están presentes en E. coli tienen composiciones de bases que difieren del contenido general de GC del 52 % de todo el cromosoma. Dentro de esta especie, algunos linajes tienen más de una megabase de ADN que no está presente en otros linajes. Las composiciones de bases de estas secuencias específicas de linaje implican que al menos la mitad de estas secuencias fueron capturadas mediante transferencia lateral. Además, las regiones adyacentes a los genes obtenidos horizontalmente a menudo tienen restos de elementos translocables, orígenes de transferencia de plásmidos o sitios de unión conocidos de integrasas de fagos . [20]
En algunas especies, una gran proporción de genes transferidos lateralmente se originan a partir de secuencias relacionadas con plásmidos, fagos o transposones . [20]
Aunque los métodos basados en secuencias revelan la prevalencia de la transferencia horizontal de genes en bacterias, los resultados tienden a subestimar la magnitud de este mecanismo, ya que las secuencias obtenidas de donantes cuyas características de secuencia sean similares a las del receptor evitarán la detección. [20]
Las comparaciones de genomas completamente secuenciados confirman que los cromosomas bacterianos son amalgamas de secuencias ancestrales y adquiridas lateralmente. Las Eubacteria hipertermófilas Aquifex aeolicus y Thermotoga maritima tienen cada una muchos genes que son similares en secuencia de proteínas a los homólogos de Archaea termófilas. El 24% de los 1.877 ORF de Thermotoga y el 16% de los 1.512 ORF de Aquifex muestran altas coincidencias con una proteína Archaeal, mientras que los mesófilos como E. coli y B. subtilis tienen proporciones mucho menores de genes que se parecen más a los homólogos de Archaeal. [20]
La génesis de nuevas habilidades debido a la transferencia horizontal de genes tiene tres requisitos. En primer lugar, debe existir una ruta posible para que la célula receptora acepte el ADN del donante. Además, la secuencia obtenida debe integrarse con el resto del genoma. Finalmente, estos genes integrados deben beneficiar al organismo bacteriano receptor. Los dos primeros pasos se pueden lograr mediante tres mecanismos: transformación, transducción y conjugación. [20]
La transformación implica la absorción de ADN con nombre del medio ambiente. A través de la transformación, el ADN puede transmitirse entre organismos emparentados lejanamente. Algunas especies bacterianas, como Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae , son continuamente competentes para aceptar ADN. Otras especies, como Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae , se vuelven competentes cuando entran en una fase particular de su ciclo de vida.
La transformación en N. gonorrhoeae y H. influenzae es eficaz sólo si se encuentran secuencias de reconocimiento particulares en los genomas receptores (5'-GCCGTCTGAA-3' y 5'-AAGTCGGT-3', respectivamente). Aunque la existencia de ciertas secuencias de absorción mejora la capacidad de transformación entre especies relacionadas, muchas de las especies bacterianas inherentemente competentes, como B. subtilis y S. pneumoniae , no muestran preferencia de secuencia.
Un bacteriófago que se ha replicado dentro de un donante puede introducir nuevos genes en las bacterias mediante transducción generalizada o transducción especializada. La cantidad de ADN que puede transmitirse en un evento está limitada por el tamaño de la cápside del fago (aunque el límite superior es de aproximadamente 100 kilobases). Si bien los fagos son numerosos en el medio ambiente, la variedad de microorganismos que pueden transducirse depende del reconocimiento del receptor por parte del bacteriófago. La transducción no requiere que tanto las células del donante como las del receptor estén presentes simultáneamente en el tiempo ni en el espacio. Las proteínas codificadas por fagos median la transferencia de ADN al citoplasma receptor y ayudan a la integración del ADN en el cromosoma. [20]
La conjugación implica contacto físico entre las células del donante y del receptor y es capaz de mediar en transferencias de genes entre dominios, como entre bacterias y levaduras. El ADN se transmite del donante al receptor mediante un plásmido autotransmisible o movilizable. La conjugación puede mediar la transferencia de secuencias cromosómicas mediante plásmidos que se integran en el cromosoma.
A pesar de la multitud de mecanismos que median en la transferencia de genes entre bacterias, el éxito del proceso no está garantizado a menos que la secuencia recibida se mantenga estable en el receptor. La integración del ADN se puede mantener mediante uno de muchos procesos. Una es la persistencia como episoma, otra es la recombinación homóloga y otra más es la incorporación ilegítima a través de una reparación afortunada de rotura de doble cadena. [20]
Los genes de resistencia a los antimicrobianos otorgan a un organismo la capacidad de hacer crecer su nicho ecológico, ya que ahora puede sobrevivir en presencia de compuestos que antes eran letales. Como el beneficio que una bacteria obtiene al recibir tales genes es independiente del tiempo y del espacio, se seleccionan aquellas secuencias que son altamente móviles. Los plásmidos son bastante movilizables entre taxones y son la forma más frecuente mediante la cual las bacterias adquieren genes de resistencia a los antibióticos.
La adopción de un estilo de vida patógeno a menudo produce un cambio fundamental en el nicho ecológico de un organismo. La distribución filogenética errática de los organismos patógenos implica que la virulencia bacteriana es consecuencia de la presencia u obtención de genes que faltan en las formas avirulentas. La evidencia de esto incluye el descubrimiento de grandes plásmidos de "virulencia" en Shigella y Yersinia patógenas , así como la capacidad de otorgar propiedades patógenas a E. coli mediante exposición experimental a genes de otras especies. [20]
En abril de 2019, los científicos de ETH Zurich informaron sobre la creación del primer genoma bacteriano del mundo, llamado Caulobacter ethensis-2.0 , elaborado íntegramente por computadora, aunque aún no existe una forma viable relacionada de C. ethensis-2.0 . [21] [22]
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